OBNOVNÉ BUNEČNÉ POPULACE Hierarchická struktura vývoje tkání ■ kožní epitel ~l střevní epitel I krvetvorné systémy ■ zárodečné populace KMENOVÉ PLEOPOTENTNÍ BUŇKY? (v kostní dřeni - potenciál vytvářet různé buněčné typy) KMENOVÉ MULTIPOTENTNÍ BUŇKY (schopné sebeobnovy, zásoba ve tkáních) PROGENITOROVE BUNKY (transit-amplifying,více diferencované, částečně schopné dělení) ZRALÉ TERMINÁLNE DIFERENCOVANÉ BUŇKY (nedělící se klidové buňky, v G0 fázi, umírají apoptózou) Je nutné, aby byla dodržována přísná rovnováha počtu a typů buněk v jednotlivých kompartmentech. Rovnováha mezi proliferací, diferenciací a apoptózou (mezibuněčné interakce, stimulační a inhibiční signály, diferenciační faktory, viabilitní faktory atd.) Linie kmenových buněk v dospělé tkáni a normální obnova tkání FALLING LEAVES APOPTOSIS \ 3. LEAVES very many DIFFERENTIA TED TISSUE CELLS 2. BRANCHES many PROGENITOR CELLS, TRANSIT-AMPLIFYING CELLS \ 1. TRUNK few STEM CELLS Fig. 1. Stem cell lineages in adult tissues and normal tissue renewal. In analogy to the structure of a tree with a very small trunk, normal tissue stem cells represent a very small proponion of the tissue cells and do not normally proliferate. The differentiating progeny of the tissue-determined stem cells is> represented by the branches, which represent lineages of cells eventually giving rise to the terminally differentiated functional parenchymal cells. represented by the leaves. For deciduous trees, loss of the leaves» at the end of the year (falling off or apoptosis) occurs in cycles, whereas in animal tissues there is a continuous production and loss of cells, Cancer results when the rate of proliferation increases and the rate of cell loss remains the same or when the rate of proliferation stays the same and/or the rate of loss decreases, Definice kmenové buňky stem cell terminally differentiated cell JFigure 22-4. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. stem cell ® / #o committed V transit amplifying cell Figure 22-7. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. y ^^H ^ • ■n terminally differentiated cells SYMMETRIC DIVISION EMBRYONAL STEM CELLS LOGARITHMIC EXPANSION ASYMMETRIC DIVISION O TRANSIT ^ AMPLIFYING O CELLS * o GERMINALAND SOMATIC STEM CELLS LINEAR EXPANSION Fig. 2. Symmetric and a symmetric division. When cells divide symmetrically, each daughter cell is identical and retains the potential of the parental cell. "When cells divide asymmetrically, one of the daughter cells remains a stem cell, whereas the other begins the process of determination [310,311]-In adult tissues, the progeny of the tissue stem cells undergoing differentiation (determination) retain the capacity to proliferate (transit-amplifying celh) and comprise the major source of celh for normal tissue renewal. Předpokládaná diferenciační dráha kmenové buňky kostní dřeně PLEOPOTENT LONG-TERM STEM CELL (very rare) .V (CD34-, C-KK+, Seal +) MULTI/PLURIPOTENT SHORT TERM STEM CELL {CD34+, cKit+, Sca1+) MULTI/PLURIPOTENT PROGENITOR J/CELL NORMAL PATHWAY ® ®®®® M\ M /ll\ III tumor /m//iwmm\ tumor (B) STEM CELL FAILS TO (C) DAUGHTER CELLS FAIL PRODUCE ONE TO DIFFERENTIATE NON-STEM-CELL NORMALLY AND DAUGHTER IN EACH INSTEAD PROLIFERATE DIVISION AND THEREBY TO FORM A TUMOR PROLIFERATES TO FORM ATUMOR The early acting growth factor which maximises host defense /ä Myeloid Stem Cell |gm-csf IL-3 CFU-GEMM GM-CSF (GM IL-3 S BFU-E CFU-Meg GM-CSF IL-3 GM-CSF IL-3 ® CFU-E EPO ■■•ť t Megakaryoblast GN GM-CSF 3 Proerythroblast Megakaryocyte Erythrocyte Platelets Neutrophilic Myelocyte I GM-CSF IC-CSF Jí Porymorpho- nucleated Neutrophil Promonocyte GM-CSF M-CSF Monocyte I GM-CSF Jm-CSF Eosinophilic Myelocyte IGM-CSF |lL-5 Basophilic Myelocyte IL-3 / IL-4 Eosinophil Macrophage Mast Ceil Změny v počtu buněk je třeba interpretovat jako změny buněčné kinetiky -sledování změn v čase. Tvorba terminálne diferencovaných buněk z časných buněčných prekurzorů - 4-8 dnů (3-6 mitotických dělení) Setrvání v periferní krvi - 10 h (neutrofilní leukocyty), 10 dnů (trombocyty), více než 100 dnů (erytrocyty). Schopnost produkce kmenových buněk - každý den vzniká asi 3x 1011 funkčních buněk - může se zvýšit až lOx. Anémie - snížená produkce erytrocytu Polycytemie - zvýšená produkce erytrocytu Kvantitativní poruchy se mohou týkat různých úrovní diferenciace erytrocytu Trombocytopenie a trombocytemie - poruchy produkce trombocytů jsou následkem poruchy tvorby nebo ploidie megakaryocytů Neutropenie - poruchy granulocytámího systému. Periferní neutropenic mohou být způsobeny zrychleným odbouráváním buněk, pomchou v jejich produkci nebo změnou j ej ich distribuce. Neutrofilní leukocytózy - podmíněny nadprodukcí nebo přesunem mezi kompartmenty (CML - příklad klonálně podmíněné leukocytózy). Lymfopenie a lymfocytózy -pomchy lymfocytů (CLL). Pancytopenie - kvantitativní pomcha několika bun. systémů Aplastická anémie - snížení hemopoetických buněk v kostní dřeni Vytvoření kultivačních systémů pro klonální vývoj hemopoetických buněk umožnilo odhalit proteiny, které regulují buněčnou viabilitu, růst a diferenciaci různých hemopoetických línií a také odhalovat molekulární základy normálního a abnormálního vývoje krvetvorných tkání. Tyto regulátory zahrnují cytokiny zvané faktory stimulující růst kolonií (CSF) a interleukiny. Různé cytokiny indukují viabilitu, množení a diferenciaci a hemopoéza je kontrolována sítí interakcí cytokinů. Tato multigenová síť zahrnuje pozitivní regulátory jako jsou CSF a IL a negativní regulátory jako TGF beta a TNF-alfa. Síť cytokinů, která vznikla během evoluce umožňuje značnou flexibilitu závisející na tom, která část sítě je aktivována a na okamžitém zesílení odpovědi na příslušný stimul. CSF a IL indukují buněčnou viabilitu inhibicí programované buněčné smrti -apoptózy. Taje též regulována geny jako p53, c-myc a bcl-2 a suprese nebo indukce tohoto programu může vyústit v podporu nebo supresi nádoru. Cytokiny, které regulují normální hemopoézu mohou kontrolovat abnormální růst jistých typů leukemických buněk a potlačovat malignitu indukcí diferenciace. Genetické abnormality, z nichž vzniká malignita jsou tak obcházeny a jejich účinek anulován indukcí diferenciace a apoptózy. Hemopoetické cytokiny objevené in vitro jsou aktivní in vivo a jsou klinicky využívány. LEUKÉMIE A LYMFOMY nekontrolovaná klonální proliferace a expanze hemopoetických buněk, které ztratily schopnost normálně diferencovat do zralých krevních buněk. Mechanismy iniciace a progrese leukémií souvisejí se změnami v normálním homeostatickém mechanismu, který reguluje produkci krevních buněk. Vzniká na různých úrovních vývoje hemopoetických buněk. Základní typy: lymfoidní a myeloidní, mnohdy těžko definovatelné Preleukemické stavy vyjadřují jen část plného leuk. fenotypu" buď expanzi růstu (myeloproliferační syndromy) nebo diferenciační blok (myelodysplasie). ► MYELOPROLIFERAČNÍ SYNDROM - expanze růstu Chronické leukémie (CLL, CML) ► MYELODYSPLASIE - porucha diferenciace Myelodysplastický syndrom malé počty cirkulujících zralých buněk, asynchronie zrání jádra a cytoplasmy. Chromosomální abnormality: delece dlouhých ramen 5 a 7 chromosomu Progrese do ► AKUTNÍ LEUKÉMIE - porucha proliferace i diferenciace cirkulující nediferencované lymfoidní (ALL) nebo myeloidní blastové buňky (AML) Heterogenní onemocnění s odlišnými epidemiologickými, histologickými, cytologickými, imunologickými a genetickými charakteristikami. Liší se projevy, stupněm malignity a odpovědí na léčbu. Vyskytují v dětském i dospělém věku Je nutná klasifikace - různé systémy, důležité pro prognózu a léčbu Nejdůležitější vyšetření, tzv. imunofenotypizace Imunofenotyp je soubor povrchových znaků - CD antigénu charakteristický pro určitý typ buněk periferní krve a kostní dřeně. Stanovení imunohistochemické a imunocytochemické - řezy tkání, nátěry - antigény se znázorňují protilátkou vizualizovanou zpravidla enzymatickou reakcí. Umožňuje současné stanovení morfologie buněk a vyšetření tkání Imunofluorescence - v buněčných suspenzích - krev, kostní dřeň, výpotky, mozkomíšní mok, suspenze ze solidních tkání. Umožňuje detekovat zkoumané antigény pomocí specifických fluorescenčně značených protilátek (fluorochromy, imunofluerescence, přímé nebo nepřímé značení). Rychlá metoda, široké spektrum protilátek. Tzv. kokteily protilátek -jedním fluorochromem značeno více protilátek, Kombinace více protilátek proti různým epitopům jednoho antigénu Stanovení - fluorescenční mikroskopie a průtoková cytometric pluripotenten kmenová bunka CFU-Meg megakaryocyt CD15 trombocyty • *"• * *' IIB/illA CD33 CD15 CDii CD33 CDU CD13^*^ neutrofi) fl B ™ rCD15 con Obr. 47A. Schéma myeloidní diferenciace s vyznačením povrchových markerů umožňujících identifikaci jednotlivých maturačních stupňu (předpokládaná leukemická transformace je vyznačena šipkou). M1-M7 = typy AL vznikající prolif e raci příslušné populace Halts :ent models rovider benchtop system capable of both cell analysis and sorting fully integrated multiparameter system, High performance, high speed cell sorter FACSDiVa (Vantage) Flow sorting instrument for the research laboratory It has combined benchtop easy-of-use with the flexibility and performance of high-end flow cytometers Building on the easy-of-use standard set by the FACSCalibur. the BD LSR offers software instrument Control, push button fluids, a and fine adjust ^SSlSESSKÍ sample flow-rate control «**■■*■*ü,»«v •»*••. b«no FACSCalibu of Institute of Biophysics, Brno Academy of Sciences Czech Republic BASICS o MMfgtilfAlA Represent: LA \\k LUID i% m 4 pH OPTICS ELECTRONICS oborcitory ylekinelics Institute of Aiophusics, Brno Hcodemy of Sciences Czech Republic fcMtí»ll Flow Chamber lonverted digital valu IL Injector HE í Sheath fluid signals Focused laser beam instruments thid (laminar fl( is accomplished by injecting through a small licrometers orrificel Cells in single file flow through an illuminated volume where they scatter light and emit fluorescence ...need to have cells in suspension !!! The speed of flowing cells Optimum for immunophenotyping: 1000 cells/s Optimum for DNA analysis: 200-300 cells/s Purdue University Cytometry Laboratories INTERACTION OF LIGHT WITH THE CELL Fluorescence is emitted, and light scattered, in all directions. THE AMOUNT OF LIGHT SCATTERED AT LARGE ANGLES (15 -150°) INCREASES WITH CELLS' INTERNAL GRANULARITY ^ AND SURFACE ROUGHNESS EXTINCTION, I. E., THE LIGHT LOSS FROM THE INCIDENT BEAM, REPRESENTS THE SUM OF LIGHT ABSORBED AND LIGH SCATTERED BY THE CELL INCIDENT LIGHT BEAM CELL THE AMOUNT OF FLUORESCENCE EMITTED MUST BE LESS THAN THE AMOUNT OF LIGHT ABSORBED, AND IS GENERALLY PROPORTIONAL TO THE AMOUNT(S) OF INTRINSIC AND/OR EXTRINSIC FLUORESCENT MATERIAL(S) jN OR ON A CELL THE AMOUNT OF LIGHT SCATTERED AT SMALL ANGLES (0.5 - 5°) GIVES A ROUGH MEASURE OF CELL SIZE but is affected by other factors., such as refractive index How Forward Angle Lighl Laser (along the same axis That the laser light Is traveling) t scatter is collected The intensity of forward scatter is proportional to the Size Shape Optical homogenity of cells (or other particles) FALS Sensor is detected in the forward scatter channel Purdue University Cytometry How 90 Degree is collected F When a laser light source is used (perpendicular to the axis that the laser light is traveling) ) (side) Light Scatter The intensity of side scatter is proportional to the Size Shape Optical homogenity of cells (or other particles) FALS Sensor 90LS Sensor is detected in the side or 90° scatter channel Purdue University Cytometry Laboratories Light Scatter Gating ide Scatter Projection Neutrophils J_L____—I___I____l_ T^T *&* I I I , I I . T I , I I , I J I I, I I i.i . i . , r ■I. ' T ii . i. i: ■.. i n . i i i Monocytes Lymphocytes 0 200 400 600 800 1000 Side Scatter Purdue University Cytometry Laboratories CELLULAR ANTIGENS Two-parametric analysis of cell surface antigens (HL-60 human leukemic cells treated with agents of differentiation) CDllb (granulocyte/ monocyte marker) CD 14 (monocytic marker] Control ATRA DMSO 0.02% 0.17% '."0.14% ■wi—i 11 ■■!—i 11 ■■! u 10 CD11bFITC CD 11b LU Ü_ ^r Q O H0U 10 CD11bFITC CD ~\ LIIIH|'hlhh| llllB| III CD11bFITC nOu 10" CD n J "j 0.14% 0.8% . é- ) : > 1 jjĚ P-12.2% cd : CD - ■■*■ B6" 1 i Anuii|'mni| .....■■ .....J CD11bFITC nOu 10" CD11bFITC CHRONICKÁ LYMFATICKÁ LEUKÉMIE (CLL) Lymfoproliferativní onemocnění - klonální proliferace lymfocytů na určité úrovni maturačního procesu s postupnou akumulací nefunkčních lymfocytů v lymfatické tkáni (slezina, uzliny, játra, kostní dřeň) i periferní krvi B-CLL - nejčastější forma, zástava mezi pre-B a zralými B-lymfocyty T-CLL - méně častá, v etiologii infekce retro virem HTVL-1, horší prognóza a odpověď na léčbu PROLYMFOCYTÁRNÍ LEUKÉMIE (PLL) CHRONICKÁ MYELOIDNÍ LEUKÉMIE (CML) je klonální myeloproliferativní onemocnění pluripotentní progenitorové buňky. Zahrnuje myeloidní, erytroidní, megakaryocyt, B- někdy T-lymfoidní elementy, ale ne fíbroblasty kostní dřeně (KD). Nemoc je silně heterogenní, má 2 až 3 fázový průběh, nej častěj i u osob nad 50 let. Specifická cytogenetická abnormalita - Philadelphia (Ph) chromozom. Molekulární marker bcr-abl zfuzovaný gen, translokace t(9;22) V minulosti byla prognóza pacientů s CML velmi špatná (stř. doba přežití 3 roky). Nyní se prognóza zlepšila díky včasné diagnóze, zlepšující se terapii a podpůrné léčbě. Léčba hydroxyureou a busulfanem podporovaná IFN a autologní transpl. KD. Nyní je stř. doba přežití asi 60-65 měsíců. S IFNalfa 20-25% pacientů přežívá. Vedlejší účinky - horečka, nechutenství, svalové bolesti, dlouhodobější - ztráta váhy, deprese, nespavost atd. Charakteriky různých typů leukémií ilustrují vztah ke stadiu zástavy diferenciace. Typické genetické změny ovlivňující jak proliferaci (aktivované kinázy) tak apoptózu (Bcl-2) Table 2 Some gene rearrangements in leukemias and lymphomas Leukemia/lymphoma Gene rearrangement Gene activated CML t9:22 bcr/abl Tyrosine Phosphorylase AML t8:21 IL-3R Tyrosine kinase APL tl5:17 PML/RARa Retinole acid receptor, blocks diff. ALL tl2:22 t9:12 TEL'MNl TELabl Transcription factors Tyrosine Phosphorylase Burkitťs (B-cell) tS:14 IgG/myc c-myc (transcription) B-cell lymphoma tl4/lS IgG/bcl2 bcl-2, blocks apotosis CLL ri ^ blocks apotosis Listed are only a few of the many gene rearrangements found in leukeinias and lymphomas. These rearrangements frequently result m translocation of a promoter and a structural gene, resulting in activation of expression of the rearranged gene. The two major classes are those that activate kinases and cause proliferation, and those that activate genes (such as bcl-2), that block apoptosis. Examples of how these gene rearrangements are manifested in leukemias and lymphomas are 1 presented in Figs. 10 and 11. gen BCR chromozom 22 ~ chromozom 9 gen abl N* gen BCR/abl Ph chromozom Obr. 2.17 Ph chromozom je produktem translokace t(9;22)(q34;q11). Na Ph chromozomu vzniká fúzní gen BCR/abl, který se významně podílí na maligní transformaci hematopoetických prekurzoru. Z. Adam, J. Vorlíček, J. Koptíková: Obecná onkológie a podpůrná léčba CHRONICKÁ MYELOIDNI LEUKÉMIE Ohr. 47,6, Kostní dřeň nemocného s CML P. Klener: Klinická onkoloeie CHRONICKÁ LYMFATICKÁ LEUKÉMIE (CLL) # • • • \ Obr. 47.7. A - obvodová krev u CLL; B - kostní dřeň u nemocného s CLL P. Klener: Klinická onkológie AKÚTNI leukémie Akutní lymfoblastické leukémie (ALL) - akumulace nezralých lymfoidních buněk v KD převážně u dětí - asi 80%> všech leukémií dětského věku a asi 25% všech dětských nádorů. Prognóza je relativně příznivá. U dospělých staršího věku asi 20% všech akutních leukémií - méně příznivá prognóza. Dva základní typy - B-ALL nebo T-ALL Akutní myeloidní leukémie (AML) - nejčastější leukemické onemocnění dospělých - až 85% AL u osob starších 20 let. Prognóza se v posledních letech zlepšila. NON-HODGKINSKE LYMFOMY (maligní lymfomy, NHL) Vznikají nádorovou transformací buněk lymfoidních tkání. Klasifikace obtížná, někdy není rozdíl mezi leukémií a lymfomem jasný. U dětí asi 12%) u dospělých 3-4% všech zhoubných nádorů Acute lymphoblastic leukemia IB Trisomy MTetrasomy MPentasomyl 100% 90% 60% 70% 60% 50% 40% 30% 20% -■ 10% 0% Fig. 1. Pattern of whole chromosome gains in massively hyperdipioid (>50 chromosomes) acute lymphoblastic leukemia without concomitant structural chromosome changes. The most frequent polysomies are those of chromosomes 21 (most often tetrasomy). X. 6. 14. 4. IS. 17. and 10. ALL - řada subtypů lišících se v odpovědi k terapii a riziku relapsu v závislosti na diagnostickém karyotypu. POLYSOMIE 25-30% - více než 50 chromozomů (hyperdiploidie) bez dalších struktur. karyotypových abnormalit Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a heterogeneous I disease characterized by the accumulation of immature lymphoid cells in the bone marrow. Subtypes of the disease differ markedly in their response to therapy and subsequent risk of relapse, not least depending on the diagnostic karyotype which is today used routinely for accurate risk assessment |and therapy tailoring [22]. "The most common cytogenetic subgroup of childhood ALL (25-30%) is defined by the pres-lence of more than 50 c liro nio some s (massive hyperdiploidy) in the leukemic cells, mostly without concomitant s truc mra 1 kary oty pi c abnormalities; this cytogenetic feature is associ-| ated with a good prognosis given state-of-the-art treatment [22]. AML - gen. změny vedoucí ke konstitutivní aktivaci receptoru pro IL-3 - aktivace tyrosin kináz a proliferace. Aktivace IL-3 receptoru podporuje růst všech typů myeloidní řady i HEMATOPOIETIC STEM CELL IL-1.IL-3: IL-6 MYELOID STEM CELL rm-csf C-CSF GRANULOCYTES ||_-3/ \IU-J \ n ^=í-^_ IU-J. EF■::-, IL-9 ^L-4 í IL-9 MAST CELLS MACROPHAGES MEGAKARYOCYTES ERYTHROBLASTS \_7 EOSINOPHILS NEUTROPHILS BASOPHILS (ä i IL-5 LIF i PLATELETS ERYTHROCYTES ® Fig. 10 Constitutive activation of the IL-3 receptor causes myelogenous leukemia. ĽL-3 is active in the proliferation and differentiation of all cells in the myeloid &erie&: including pol^inophonuclear leukocytes, monocyte^ megakarocytet (platelets), and erythrocytes. Thut^ constitutive activation of the IL-3 receptor results in an increase in the precursors of all of these cell types, a characteristic of acute myelogenous leukemia. Modified fiom [316]. B-lymfomy, Burkittův lymfom Translokace a aktivace imunoglobulinového (Ig) promotoru spojená s aktivací genů c-myc (podpora proliferace) a Bcl-2 (blok apoptózy) Rychlý nárůst nezralých B buněk, které neumírají Genetická změna v kmenové bunňce, ale růst nádoru je určen stadiem maturace, kde dojde k aktivaci Ig promotoru. PLURIPOTENT BONE MARROW STEM CELL \^J<^ HEMATOPOIETIC STEM CELL I I*), LYMPHOID STEM CELL Ig PROMOTER ACTIVATED IN B-CELLS Myc - proliferation Bcl-2 - immortalization 1^0 .............h B-CELL PLASMA CELL Fig. 11. Activation of immunoglobulin promoter linked to oncogene (c-Myc) and-'or apoptosis blocking gene (Bcl-2) produces B-cell cancer in transgenic mouse model of Biirkitťs lymphoma. B-cell lymphomas occur when the immunoglobulin gene promoter is linked to an oncogene (c-Myc) and-'or a gene that codes for the apoptosis blocker,. Bc!-2. Although the Ig-promoter/oncogene translocation is present in every cell in the animal, the promoter is only activated in B-celk, so that other cells in the lymphocytic lineage are not affected. 1) MALIGNÍ TRANSFORMACÍ POSTIŽENÁ B-BUNĚČNÁ ŘADA: r kostní dřeň ALL pre-pre-B buňky > pre-B buňky r periferní lymfatické orgány __________<__________ NHL, B-buněčná CLL ^\ f maturované B buňky 1) MALIGNÍ TRANSFORMACÍ POSTIŽENÁ T-BUNÉČNÁ ŘADA: thymus lymfatické uzliny, kůže i-----------------m—K—\ ALL, lymfoblastické T-buněcne lymfomy lymfomy t t stádium III maturované T CD4+ IL*™ stádium I stádium l^^ stádium III maturované T CD8 T-buněčné CLL kostní dřeň MM t plazmatické buňky ®h§m§m§k#h§k<§k<§^ C3> Obr. 2.15 Typ hematoonkologického onemocnění, které se bude vyvíjet, závisí na vývojovém stadiu lymfoidní prekur-zorové buňky zasažené maligní transformací. Z. Adam, J. Vodiček, J. Koptíková: Obecná onkológie a podpůrná léčba nediferencovaná AU c-ALL H L ADR CD34 CD19 t HLÁDR f CD34 CDJ9, pre-B-ALL HLADR t CD10 CD 19 Burkift B-ALL CLL PLL NHL HCL qbbuíinémie HCD HLADR t HLADR CD21 CD19. > ! DIO HLADR CD21 CD 19-^ Pi'CD20 HLADR f CDS CD2i CD19A ----►u- píazrnocyfom fCD38 žZ VCA1 CD20 B-iymfoidní prekurzor pro-B lyrnfocyt pre~B čosný B lyrnfocyt iymrocyt HLADŔ CD34 prechodný B zralý B lyrnfocyt lymíocyf Sm!g+ Smig + CD20 "<žzy iymfo- plazmatická plazmocyt buňka Smíg- C!g + píunpotením kmenová buňka ±CD2 nezralý tymocyt CD7 CD4 —► přechodný tymocyt ICL CD7CD5^r 2ralý T-iymfocyt »supresor« CD7CD5 CD2 -ICL mycocis íungoides Sézaryho syndrom -T-CLL y^ erytrocyty ► granuiocyiy ^ řrombocyry zralý tymocyt zralý T-lymfocyt »helper« monocyfy myeioitím kmenová Obr, 47A. Schéma lymfoidní diferenciace s vyjádřením vztahu k různým lymfoproliferačním onemocněním. Tato onemocnění mohou vznikat maligní transformací lymfocytu v kterémkoliv stadiu jeho postupného vyzrávaní. Fenotyp buněk v patologické populaci se podobá fenotypu jejich normálních protějšků. ALL - akutní lymfoblastická leukémie; PLL - prolymfocytární leukémie; HCL - trichocelulární leukémie; CLL - chronická lymfatická leukémie; NHL - nehodgkinský lymfom; HCD - choroba z těžkých řetězců; LL - lymfocy-tární lymfom; Smi g - povrchový imuno globulin; TdT - terminálni deoxynukleotidyltransferáza; CIg - cyto-plazmatický imuno globulin; cALLA - společný leukemický antigen P. Klener: Klinická onkoloeie 0OÄl • •' tfJ»* UNDIFFERETIATED/BLASTIC ACUTE MYELOGENOUS GROWTH FRACTION: >9:10 TIME TO DEATH: MONTHS CELL DO NOT ENTER Gn MODERATELY DIFFERENTIATED CHRONIC MYELOGENOUS GROWTH FRACTION: 1:10 TIME TO DEATH: YEARS SOME CELLS DIFFERENTIATE WELL DIFFERENTIATED CHRONIC LYMPHOCYTIC GROWTH FRACTION: <1:1000 TIME TO DEATH: DECADES VERY LOW GROWTH FRACTION CELLS DO NOT DIE A P P °x /\ T\ IX oooooo o 00 0*0-, ♦ o + Fig. 12. Growth fractions, morphology, and clinical course of three selected leukemias. In acute myelogenous* leukemia, the tumor cells are arrested in Bin active growth phase: cells that divide and do not enter Go, but pass directly into the next cell cycle. Few, if any, differentiated cells are seen; the tumor is made up of blast cells. The growth fraction is very high, the expansion of cells is essentially exponential, and the time to death, if the disease it not treated, is within a few months. In chronic myelogenous leukemia, the aires t i a at the level of the transit-amplifying cell*. The number of cycling cells is much smaller, and a much higher proportion of the tumor cells undergoes differentiation so that many cells at various stages of differentiation are seem. The growth fraction is small, and the time to death is years. In chronic lymphocytic leukemia, maturation arrest occurs in small non-dividing cells. The functional change is a lack of cell death. The vast majority of the cells are in Go, so that the growth fraction is vanishing small, and the time to death is decades. Modified from [317]. Obr. 47.2. Kostní dřeň u akutních leukémií. A - akutní myeloblastová leukémie (M,); B - akutní myeloblastová leukémie (M2); C - akutní promyelocytární leukémie (M3); D - akutní lymfoblastická leukémie P. Kiener: Klinická onkológie a) amplifikace b) BCR translokace BCR ablP\ i abl 0 -> SCR 8 SCR Q Q BCR/abI ■'■■■ Obr. 2.20 Dva příklady využití techniky fluorescenční in situ hybridizace (FISH). a) Analýza amplifikace genu myc, V normální buňce se sonda specifická pro gen myc naváže pouze na dvě kopie genu na obou chromozomech a při analýze FISH dává pouze dva signály. Po amplifikaci genu se sonda naváže také na všechny nově vzniklé kopie a při analýze FISH poskytuje odpovídající počet signálů. b) Detekce translokace BCR/abL Použijeme dvě odlišně značené sondy pro oba analyzované geny. Ph analýze normální buňky dostáváme dva a dva oddělené signály, zatímco v buňce, ve které proběhla translokace, do-stáváme směsný signál v důsledku emise fluorescence ze sond lokalizovaných v těsném sousedství. Z. Adam, J. Vodiček, J. Koptíková: Obecná onkológie a podpůrná léčba r P. Kiener: Klinická onkolosie .•"vOBLASTirí-/ m Wßm» možný vývoj -----fr možné sdružení Obr. 47.5. Vzájemné vztahy myeloproliferačních onemocnění Všechny elementy krve a lymfy jsou odvozeny během fetálního a dospělého života od pluripotentní hemopoetické kmenové buňky. Nachází se v malém počtu v kostní dřeni a většina z nich se aktivně nedělí. Pokrok v izolaci a charakterizaci pluripotentní kmenové buňky pomáhá k poznání s ní souvisejících malignit. Lidské kmenové buňky nesou povrchový znak CD34 a jsou schopny tvořit řadu kolonií v semisolidním prostředí v odpověď na různé specifické růstové faktory. Jisté lidské leukemické buňky jako chronická myeloidní leukémie (CML) nebo akutní myeloidní leukémie (AML), které představují velmi nezralé kmenové buňky nebo prekursory jednotlivých linií, se jen velmi obtížně kultivují in vitro, přesto, že v pacientech rostou velmi rychle. Chybí asi specifické faktory dodávané mikroprostředím kostní dřeně. V současné době byl objeven nový tzv. steel faktor produkovaný stromálními buňkami a jeho receptor c-kit přítomný na řadě hemopoetických buněk. U myší byly definovány dva genetické lokusy regulující vývoj kmenové buňky - steel (SL) a white-spotting (W). W lokus kóduje c-kit onkogen, což je člen třídy onkogenu pro tyrosin kinázové receptory. Je to receptor pro produkt genu SI majicí růstově promoční aktivitu pro mnoho hemopoetických linií a vykazující synergii s dalšími růstovými a diferenc. faktory jako GM-CSF, Epo a IL-7. SI faktor je považován za kritický pozitivní efektor růstu a vývoje kmenových buněk. Proto je věnována pozornost jeho roli v růstové rsgulaci u leukémií, které představují primitivní typy kmenových buněk. Poměrně dobře je objasněna úloha stromatu kostní dřeně v regulaci normální krvetvorby. Byly vytvořeny dlouhodobé kultury pro myeloerytroidní a lymfoidní vývoj. Rada údajů předpokládá, že_vzájemné kontakty buněk a specifické účinky extracelulární matrix pomáhají regulovat vývoj kmenové buňky. Různé typy leukémií se mohou lišit od normálních protějšků tím, že nevyžadují dále blízký buněčný kontakt pro růstovou expanzi a cirkulaci v krvi. Při vývoji buněk kostní dřeně existuje kontrola a rovnováha, která limituje celkovou buněčnost a odpověď na stresy jako záření, krvácení a pod. Existují údaje o negativních regulátorech kmenových i liniově specifických buněk, např. TGF beta produkovaný stromálními buňkami. Pozornost věnována tomu jak kmenové buňky a různé leukémie unikají této negativní kontrole. PROGENITOROVA BUŇKA MÍSTO BUNĚČNÉ ADHEZE RECEPTOR pro růstový faktor Proteiny matrix Membrána STROMALNI BUNKA Růstový faktor (indukovaný) Model prostorové organizace hemopoetických kmenových buněk a růstových faktorů v mikroprostředí kostní dřeně IL-4 I T buňka 1^ I B buňka 1 LPS G-CSF Kostní dřeň Protilátka Siť interakce cytokmu, positivní a negativní zpetna vazba IFN-y, interferon gamma LPS, lipopolysacharide TNF, tumor necrosis factor Línie výzkumů mechanismů působení retro viru indukujícího erytroleukémii vedlo k odhalení, že virové proteiny mohou stimulovat růst hostitelských buněk tím, že působí jako pseudoligandy pro receptory růst. faktorů. U lidských i živočišných leukémií byly identifikovány geny homologní se známými transkripčními aktivátory. Některé hrají roli v diferenciaci hemop. buněk, protože jsou homologní nebo identické s geny dříve identifikovanými v jiných experim. systémech jako geny ovlivňující vývoj a diferenciaci. Existuje tedy vazba mezi onkogenezí a transkripční deregulací. Aktivace transkripčních faktorů Zvýšená exprese specifických CSF receptoru Matu race indukovaná transkripčními faktory a CSF CD34 Gata-1 C/EBPoc GM-CSF R myeloidní prekursor G-CSF R I I—►{ ' myeloidní ^prekursor> ¥ --------►' I [ M-CSF R ] erytroidní prekursor EpoR PU.1 G-CSF Neutrofil Monocytární nrekursor M-CSF EpoR Model indukce hematopoetické diferenciace specifickými transkripčními faktory. Transkripční faktory jsou málo exprimovány u kmenových buněk CD34. Působením blíže nedefinovaných signálů, jako je vliv interakce ve stromatu nebo signály růstových faktorů, dochází k upregulaci specifických tr. faktorů např. GATA-1 or PU.1. To vede k jejich autoregulaci a upregulaci specifických receptoru pro růstové faktory, což má za následek vzestup proliferace, diferenciace a supresi apoptózy specifických linií. Downregulace specifických faktorů (jako je GATA-1 během myeloidního vývoje) může také hrát důležitou úlohu. V normální buňce je rovnováha stimulačních a inhibičních signálů pečlivě regulována, protože to souvisí s regulací buněčného cyklu, který je rozhodující pro buněčnou proliferaci a diferenciaci. V nádorové buňce je v důsledku změn v signálních drahách organizace buněčného cyklu narušena. Buňka je vybavena také zpětnovazebnými mechanismy, které mohou působit proti neobvyklým změnám v procesu bun. dělení. Patří k nim např. programovaná buněčná smrt - apoptóza, schopnost buňky spáchat za určitých podmínek sebevraždu, tj. jestliže její základní komponenty jsou porušeny nebo jestliže je její kontrolní systém deregulován. Tak působí např. poškození chromozomální DNA. V tomto procesu se účastní také specifické geny např. p53 nebo bcl-2. Mutace těchto genů pak způsobují poruchy apoptózy. Neschopnost apoptózy přispívá ke vzniku nádorů a k jejich rezistenci k terapii. xxxxx Cell Cycle Control Genes in Haematopoiesis Differentiation Cell type: Stem cells Committed progenitors Morphologically-identifiable cells Function: Self renewal Blood pool expansion Terminal differentiation cdc2 + cdk2| cyclins ^ p16f Cell cycle G0/G1 arrest status: (slow cycling) cdc2 f cdk2 f cyclins f p16 + | p211 | S-phase entry (active cycling) p15f I cyciin D1 f f icdc2 f m WBC RBC cyciin D3 f p21f \ • V l mm Imgk ^ ssasaiss r G0/G1 arrest (differentiated) Exprese genů kontrolujících buněčný cyklus v jednotlivých stádiích hematopoetické diferenciace a její vztah k funkčnímu stavu. TERAPEUTICKÉ ASPEKTY VYUŽITI CYTOKINU Identifikace řady protoonkogenů jako růst. faktorů nebo jejich receptoru a důležité účinky těchto proteinů na hemopoetické buňky vedly k hledání dysregulace růst. faktorů a jejich receptoru u leukémií. Biologická terapie s vvužitím cvtokinu a rustovvch faktorů představuje Hemopoéza může být ovlivňována buď hemopoetickými růstovými faktory nebo negativními regulátory, které mohou zabránit poškození kmenové buňky během chemoterapie. Na základě poznatků o autokrinních mechanismech růstu mohou být klidové maligní buňky uvedeny do buněčného cyklu svými růstovými faktory, čímž se stanou citlivější k chemoterapii. Vědomosti o biologické terapii jsou teprve na počátku, zvláště pokud se týče všech aspektů propojené sítě cytokinů. Cytokiny a růstové faktory přenášejí signály mezi hemopoetickým a imunitním systémem buď samotné nebo indukcí uvolňování dalších cytokinů. KONTROLA HEMOPOEZY A LECB A ► pozitivní regulace - využití hemopoetických tzv. kolonie stimulujících růstových faktorů (CSF): erytropoetin, G-CSF - granulocytární růst. faktor, M-CSF - monocytární růst. faktor, GM-CSF - granulocytární-makrofágový růst. faktor, interleukin3 (IL-3) ► negativní regulace hemopoézy - prevence poškození kmenových buněk při chemoterapii - TGF ß ► autokrinní růst - blokáda přenosu růstových signálů antagonisty růstových faktorů, receptoru a inhibitory dalších stupňů přenosu signálů (inhibitory PKC, lipidového metabolismu, "antisense" látky, atd.) ► imunomodulační látky - ovlivnění imunitního systému hostitele (IL-2, interferon alfa a gama Hemopoéza je regulována více než 20 dobře charakterizovanými faktory definovanými jako kolonie stimulující faktory, interleukiny a cytokiny. Některé z těchto faktorů jsou běžně používány, ale potenciální klinické využití není úplně objasněno. První byl využit erytropoetin. Ovlivňování pacientů cytokiny podléhá zcela jiným pravidlům, nežli působení cytotoxickými látkami. Cytokiny mají široké spektrum účinků in vivo jako je modulace imunitní odpovědi, stimulace hemopoézy, přímá regulace buněčného růstu a diferenciace, toxicita pro nádorové buňky, účinky na vaskularizaci nádorů apod. Navíc nevykazují jen primární účinky, ale spouštějí kaskádu sekundárních účinku. Erytropoetin ► stimulace erytropoézy po chemoterapii a transplantaci KD ► u některých lymfoproliferačních poruch jako jsou mnohočetné myelomy a chronická lymfocytární leukémie ► u anémií spojených s chronickým onemocněním (nádory, AIDS) ► v programech autologního odběru krve CSF (colony stimulating factors, GM-CSR G-CSF* ► prevence a ovlivnění myelosuprese ► intenzifikace chemoterapeutických programů s nebo bez autologní podpory progenitoru z kostní dřeně (KD) nebo periferní krve ► rekonstituce krvetvorby po chemo- a rádioterapii a autogenní nebo allogenní transplantace KD ► podpora a expanze progenitoru periferní krve ► stimulace hemopoézy u syndromů poruch v KD jako je cyklická neutropenie, aplastická anémie ► aktivace efektorových buněčných funkcí (AIDS, poruchy funkce leukocytu) ► zvýšení účinnosti cytotoxických léčiv vybuzením klidových leukemických buněk Kostní dřeň obsahuje asi 0.001% pravých kmenových buněk, lOx víc "multilineage" progenitorů a lOOx víc liniově specifických progenitorů. U dospělcu cirkuluje v perif. krvi asi 5-10% počtu progenitorových buněk v KD. Představují asi 0.1 % mononukleámí frakce perif. krve. Vyvinuty metody zvýšení cirkulujících progenitorů aplikací specif, cytokinů. CD34+ je glykosylovaný povrchový antigen exprimovaný především kmenovými a méně progenitorovými buňkami. Byla vyvinuta řada metod pro selekci buněk s tímto znakem. S vývojem metod in vitro kultivace lze tyto buňky namnožit s pomocí synergického působení kombinace cytokinů (steel faktor + další), pak reinfuze. Využití vysokých dávek chemoterapeutik, které účinně působí na citlivé nádory je omezeno vedlejšími účinky s hematologickou toxicitou. Jednou z cest jak překonat tyto obtíže je metoda transplantace kmenových buněk z periferní krve (PBSC), která je alternativou k transplantaci kostní dřeně (KD) a je stále více využívána. Výhody: ► sběr PBSC leukaferézou probíhá mimo pacienta bez potřeby anestézie a možností autograftu v případě ovlivnění KD infiltrací nádoru, fibrózou nebo hypoplasií po chemo- a rádioterapii ► dochází k rychlejšímu obnovení granulocytopoézy a megakaryocytopoézy ► redukována možná kontaminace transplantantu maligními buňkami. MYELODYSPLASTICKY SYNDROM (MDS) je získaná k lomí In í porucha kostní dřeně charakterizovaná kvantitativními i kvalitativními poruchami v hemopoéze (hodně u starších lidí - není možná drastická terapie) Rada léčebných protokoluje zaměřena na využití diferenciační ch látek k podpoře zrání blokovaných buněk. Existují in vitro modely, kde je možno pomocí retinové kyseliny, DMSO nebo vit D3 příp. G-CSF, GM-CSF navodit diferenciaci. Avšak v praxi u pacientů nepřinášejí žádoucí výsledky. Kyselina all-trans retinová (ATRA) je nyní efektivním lékem při léčbě akutní promyelocytární leukémie (APL). Na MDS má však malý účinek (genetický důvod - absence translokace 15,17 důležité pravděp. pro klinický účinek ATRA). Rekombinantní růst. faktory jako GM-CSF a IL-3 jsou u MDS pacientů úspěšně využívány ke zvýšení počtu cirkulujících bílých krvinek a destiček. Diferenciace myeloidních leukemických buněk do nemaligních zralých makrofágů nebo granulocytů (a) (d) (b) ;* f rvV > Ster' dfc'r*^ WV'(c) (e) (O (g) Figuře 5. Differentiation of myeloid leukaemic cells to non-malignant mature macrophages or granulocytes by normal myeloid differentiation-inducing protein IL-6. (a) Leukaemic cell; (b) macrophage; (c) colony of cells with macrophages; (d-g) stages in differentiation to granulocytes [74].