BAC/PAC knihovny a jejich využití pro FISH techniku Mgr. Gabriela Galiová Obsah • BAC, PAC, YAC systémy, klonování, selekce, knihovny, využití • příprava DNA sondy - izolace a purifikace plazmidove DNA - nick translace - Cot1 DNA • FISH - typy a využití Co to je? • BAC (Bacterial Artificial Chromosome) • PAC (P1 Artificial Chromosome) • YAC (Yeast Artificial Chromosome) • uměle syntetizovaná plazmidová DNA, kterou lze do „organizmu" (vektor) vložit • vektor x klonovací vektor několik tisíc bp IKlKUNSflMHHH • BAC, PAC, YAC klonovací vektory jsou agens, které vnášejí úsek DNA do hostitelské buňky - E Schema klonování do PI vektoru Klonovací vektor musí obsahovat: - počátek replikace - místo pro reštrikční endonukleázu (jedno) - gen pro rozlišitelnou vlastnost jťfWfTiilkíiliN.i, ■■rfiil&r fnpjncri tirteťTKätťpnu MM ľiklii '. ili-'.T "tJUÍfa" Lipan väJnrei PL IŕSWfiWftKt tltklrtn** Kl i srltkie ri.'H-ntŕniE m ňiídiii f.kuiirTfPLxcrii iíh (yiiťkí rqJiknn ľ I Hostitelská buňka • Escherichia coli (G-, Enterobacteriaceae) • vhodný modelový organismus protože: - je dobře znám jeho genom (kruhová molekula dna) - nenáročně se kultivuje, rychle roste, produkuje početné potomstvo (dělení) - obsahuje F-faktor = konjugativní plazmid o velikosti 100 Kb, který odpovídá za přenos genetické informace z F+ do F- buňky • plazmid má vlastní počátek replikace - replikuje se nezávisle na bakteriálním chromozomu Prenos DNA do bakterií konjugace: donorová buňka —► recipientní buňka T+ r—V /—> f—v—\ v____y v____> \___/ f V \ O L J F+ F+ /"-------\ i'-------% cDNA (nepřerušená kódující sekvence genu - lze vyčíst aminokyselinové složení proteinu a využít je pro jejich syntézu v bakteriích nebo kvasinkách) • hledání v knihovnách: pomocí sond a) pro vyhledávání sekvencí DNA b) pro vyhledávání produktů hledaných genů http://bacpac.chori.org/ http://www.biologia.uniba.it/rmc/ Konstrukce BAC knihoven • linearizace vektoru restrikčními enzymy a ligace s naštěpenou genomickou DNA • produkt elektroporací nebo chemickou transformací (CaCI2) vnesen do E. coli a transformanty selektovány na plotnách s antibiotikem nebo IPTG a X-gal • vybrané transformanty jsou razeny do mikrotitračních destiček • vektory pomnožovány v kmenech E. coli s poruchou rekombinace (DH5a, DH10B) Konstrukce PAC knihoven • linearizace vektoru restrikčními enzymy a ligace s fragmenty DNA • produkty ligace zabaleny do fágových kapsidů a pak infekce buněk E. coli • selekce {sacB) na médiu s antibiotikem a sacharózou • uchování v mikrotitračních destičkách: a) na 1 jamku více klonů (nevýhodné) b) na 1 jamku 1 klon Klonování do BAC vektoru • asi nejpoužívanější je vektor pBeloBAC11 • postup: linearizace vektoru, ligace s fragmenty genomické DNA, elektroporace nebo chemická transformace do E. coli • selekce a uchování (LB médium s antibiotikem a 30% glycerolem na -70°C nebo vpich do média při RT) • izolace DNA z transformantů její analýza (PFGE, PCR) Vektor pBeloBACll (klastr globinových genů) 5 HS: 5 4 3 2 1 -ia -10,9 -214 -14,7 -6,1 PAC 4396 (ISO Kb) I-----//- 5 HS: 1 +21,8 Mil: GY AT Vp 5 >____!____!__■________■__m__m____h. BAC 4396-44 (100 Kb) ,_ Sali Sna BI Xhol Xbal -//- -H ECORV EcoRV Schema klonování do PI vektoru ggavxnirktPNA ■rfuILcr íhpincrt tirteťTKätťpnu MM i'lii:- '. ilr'.v "tJUÍfa" Li.rar* veliDrajPL řcrcmiíkf DK.-\ IŕSWfaňftKt tl*lrt1*tf Kl i scltkií ri.'H-ntŕniE m ňiídiii f.kuiirTfPLxcrii iíh (yiiťkí rolil..-.ii ľ I E. coli Po nárůstu bakterií na agaru se 1 kolonie (populace jedné bakterie) naočkuje do tekutého LB média a přes noc inkubuje při 37°C. Příprava DNA sondy • nejprve izolace DNA z příslušného BAC nebo PAC vektoru pomnoženého v E. coli • izolace klasickou metodou s vlastními roztoky nebo izolačním kitem • izolace kitem je výhodnější (větší výtěžek, odstranění bakteriální DNA) • DNA je polární (- náboj) —► snadná precipitace alkoholem, možnost elektroforézy Schéma izolace DNA pomocí QIAGEN Large Construct Kit - lyzační pufry rozruší buňky - isopropanol vysráží DNA - etanol přesráží DNA - kolonky odstraní bateriální DNA a RNA - rozpuštění DNA v TE pufru, H20 - měření velikosti a čistoty DNA pomocí gelové elektroforézy, spektrofotometrie, nanodropu QIAGEN Large-Construct Kit Procedure Pelleted bacteria i Alkaline lysáte I 4T9 Clear lysáte Isopropanol precipitate f^9 Collect DNA by centrifugation =j Exonuclease digestion I Bind DNA Wash Elute 1 Isopropanol precipitate Collect DNA by centrifugation * Genomic DNA-free ultrapure plasmid DNA Čistota a koncentrace DNA Čistota DNA: poměr A260/A280 • A260/A280 = 1,8-2 ^ ideální hodnoty • A260/A280 > 2 -»■ kontaminace RNA • A260/A280 < 1,8 -»■ kontaminace proteiny Koncentrace dsDNA: • maximální absorbance nukleotidů při 260nm 1OD = 50|jgDNA/mlH2O (optická denzita, A260 = 1) ffc Edt tW »*. Rsůlonk fliirt Screen nscůfifing Maosure lil.nik 1 ■ iv ■■■ ij niI Ühnw lícpnrl | rnrnprnCn ?ti.(l4 ř4lC/ 10 UÍ IJ^r mřim>». J ř.o-ac A-ÍÍO 1B mm pnlli | 2.11-9(1 A-ÍÍB II mm polil | I.DB1 ?6ivíaa! I.A7 řÉO/rDDl 2.1* ■^l 104,5 N íck-trans lace • vlastní příprava sondy inkorporací např. digoxigeninu do DNA • nick-translační kit obsahuje 2 enzymy: - DNáza 1 5' 3- 3' . 5' 5' 3' 3' 5' 200-500 bp - E. coli polymeráza 1 • každý 20.-25. nukleotid je modifikován DIG-dUTP • vznik fragmentů o velikosti 200-500 bp c )NA po izolac (pBeloBACH) — bakteriálni DNA — plazmidová DNA DNA po nick-translaci pBeloBAC11 PAC825K22 200-500 bp Cot-1 DNA • v lidském genomu jsou rozptýlené repetitivní sekvence SINEs, LINEs (např. Alu-elementy, L1-elementy) • tyto repetice jsou obsaženy i v DNA sondě • competitor DNA - lidská placentální DNA obohacená repetitivními sekvencemi • repetitivní elementy sondy hybridizují s přebytkem repetic na COT-1 DNA • nejvíce specifická místa na sondě zůstanou volná (jednořetězcová) pro hybridizaci na cílovou DNA • potlačuje hybridizaci sondy na repetitivní sekvence Dři FISH a zvýší se tak specifičnost (přesnost) lybridizace Stručný návod k použití Cot-1 DNA ke 120 ng značené DNA přidat 6 ug Cot-1 doplnit salmon sperm DNA do mn. 20 ug přidat 1/10 objemu 3M octanu sodného a 2 objemy 96% etanolu (-20°C) promíchat, inkubovat 30 min při -70°C centrifugovat 15min/13000 rpm, slit supernatant promýt DNA 400 ul 70% etanolu (-20°C) centrifugovat 5min/13000 rpm, slit supernatant sušit pelet a rozpustit ve 20 ul hybrizolu (50% formamid a 2xSSC) FISH (Fluorescenční In Situ Hybridizace) • metoda stanovení lokalizace specifických sekvencí DNA nebo i celých chromozomů v buněčných preparátech • princip spočívá v navázání značené denaturované DNA sondy na komplementární místo cílové denaturované DNA • druhy DNA sond: místně specifické (genové), celochromozomove, telomerické, centromerické • typy DNA sond: - oligonukleotidove (chemicky syntetizované) - jednořetězcové (RT-PCR, PCR) - dvouřetězcové (BAC, PAC, YAC klony) - RNA sondy • přímé a nepřímé fluorescenční značení • duální barvení, SKY (spectral karyotyping), multicolour FISH, opakovaná hybridizace • rozsáhlé klinické využití (prenatální diagnostika, cytogenetika nádorů) Schema FISH Fluorescence In-Sltu Hybridization (FISH) chraiDiDM on cílová DNA ĽM& doubla Jif-I i.-. I I I I I I I I TUATCOT I I I I I I I 4 ÄTÍTHÍA I I I I J_L dciiatu: tUäTÍ i T a t '.' t ;, í i ;, ....... dinatuct I I I I hybr-idise probe tu d«£utťuľad chromosome V DNA sonda Majce oomplsn,si-|.taviř probe labelled with fluerucent utrhei TňíÄTCCT mum .t->. rrfrr?rr .7-^ ......n TdSATCCT I I I I I I I I ftTCTA**ft ........ nepřímé značení - sekundární protilátka Nejčastěji používané látky • nepřímé značení DNA sondy: ligandy typu digoxigenin, biotin (Roche) • sekundární protilátky: Anti-DIG-Rhodamin, Fluorescein-avidin (Roche), FITC-avidin (Sigma) • barvení jádra: DAPI (4',6-diamidin-2'-fenylindol), TO-PRO®-3 iodide, PI (propidium iodide) • přímé značení DNA sondy: Spectrum Orange, Green, Red, ... (Invitrogen), Cy3 (Cambio) SKY te (spectral k 12 3 4 S t )isin;;n> 6 7 fl í 10 11 12 tl II 4\ l\ ii II 13 14 15 1Q 17 IB n m m «t It IB 20 21 22 ■ www.genome.gov Duální barvení ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^V t ^^H umístění ß-globinoveho genu (červené signály) v rámci chromozomálního teritoria chromozomu 11 (zelené signály) u lidských leukemických buněk K562 Opakovaná DNA/DNA hybrídízace Ľ? fcj klastr globinových genů chromozom 11 centromera chromozomu 11 • klonování do BAC, PAC vektoru a transformace • izolace plazmidové DNA z bakterií, purifikace izolované DNA • inkorporace značených nukleotidů pomocí nick-translace - značení sondy • vystínění repetitivních sekvencí sondy pomoci Cot-1 DNA • hybridizace cílové DNA připravenou sondou pomoci FISH • promytí přebytečné sondy a detekce signálů