Epigenetické procesy probíhající v buněčných jádrech. Eva Bártová Biofyzikální ústav AV ČR Brno What is epigenetics ? Epigenetics refers to heritable changes in the phenotype that occur irrespective of alterations in the DNA sequences. N-koncové oblasti histonů H2A, H2B H3a H4 (délka 16-44 aminokyselin nejsou součástí jádra nukleosomu, ale vybíhají do stran (volné konce). V linkerové oblasti ­ H1: funkce na kondenzaci chromatinu vyššího řádu. 1. Buňka může existovat i bez významně redukovaného množství H1. 2. H1 varianty nejsou hlavní determinanty buněčného fenotypu. 3. Funkce H1 variant je nejenom při utlumení transkripční aktivity ale také při její aktivaci (může snižovat nebo i zvyšovat expresi specifických genů. 4. H1 hraje důležitou úlohu v kondensaci chromatinu. Spíše je důležitý pro stabilizaci nukleosomů než pro vlastní řízení kondenzace chromatinu. 5. Experimentálně navozená redukce H1 vede ke zkrácení linkerové DNA The linker histone H1 is involved in maintaining higher-order chromatin structures and displays dynamic nuclear mobility, which may be regulated by posttranslational modifications. H1 tail phosphorylation play in important role. Using the technique of fluorescence recovery after photobleaching, Contreres et al., 2003 observed that the mobility of a GFP-wild-type H1 fusion protein is dependent on Cdk2 activity. GFP-H1 mobility was decreased in cells with low Cdk2 activity but not in the cells with bloked phophorylation of H1. Blocking the activity of Cdk2 by p21 expression decreased the mobility of GFP-H1. These data suggest that CDK2 phosphorylates histone H1 in vivo, resulting in a more open chromatin structure by destabilizing of nucleosomes. Overexpression p21 GFP-H1b GFP-M1-5 GFP-M1-5: five cyclin-dependent kinase phosphorylation consensus sites were mutated from serine or threonine residues into alanines GFPGFP Pacific jellyfishPacific jellyfish,, AequoriaAequoria victoriavictoria The linker histone H1 is involved in maintaining higher-order chromatin structures and displays dynamic nuclear mobility, which may be regulated by posttranslational modifications. H1 tail phosphorylation play in important role. Using the technique of fluorescence recovery after photobleaching, Contreres et al., 2003 observed that the mobility of a GFP-wild-type H1 fusion protein is dependent on Cdk2 activity. GFP-H1 mobility was decreased in cells with low Cdk2 activity but not in the cells with bloked phophorylation of H1. Blocking the activity of Cdk2 by p21 expression decreased the mobility of GFP-H1. These data suggest that CDK2 phosphorylates histone H1 in vivo, resulting in a more open chromatin structure by destabilizing of nucleosomes. Overexpression p21 GFP-H1b GFP-M1-5 GFP-M1-5: five cyclin-dependent kinase phosphorylation consensus sites were mutated from serine or threonine residues into alanines Varianty histonů H1: varianty H1o, H5 a testis-specific varianta H1. varianty H1 se různě uplatňují během buněčného cyklu, diferenciace a vývoje. RA diferenciace myších F9 je doprovázena zvýšenou transkripci histonu H1o. H2A: H2A.X, H2A.Z, MacroH2A, H2A-Bbd, H2AvD, H2A.X. varianta H2A.Z je konzervativní během evoluce. Macro H2A se vyskytuje u Xi, zatímco H2A-Bbd u Xa chromosomu a autosomů. H2A.Z se vyskytuje v intergenických oblastech. H2B: nemá varianty, uplatňuje se při regulaci kondenzace chromatinu, represi transkripce a během gametogeneze, H2B je zodpovědný za uspořádání chromatinu u spermií. Varianty histonů H3: existují dvě hlavní Varianty H3.3 a centromerické varianty H3 (cenH3) = CENP A: jsou zodpovědné za vazbu kinetochoru a segregaci sesterských chromatid u eukaryot Varianty histonů H3: phosphorylation of CENP-A on Ser-7 is essential for kinetochore function. Overexpression of CENPA plays an important role for aneuploidy in colorectal cancers. Varianty histonů H4: většina genů kódujících hlavní histonové proteiny jsou exprimovány během S fáze buněčného cyklu. V případě H4, geny jsou konstitutivně exprimovány během buněčného cyklu. Pro H4 nejsou známy žádné varianty. Chemické modifikace histonů ˇ Dynamická struktura chromatinu je přímo ovlivněná postranslačními modifikacemi amino-konců histonů * Typy histonových modifikací: a) acetylace, b) methylace, c) fosforylace, d) polyadenylace, e) ubiquitinace * Methylace histonů byla objevena již před 30 lety. Vztah mezi acetylací a metylací histonů: acetylace histonů je katalyzována histon acetyltransferázami (HATs) a odstraňována histon deacetylázami (HDACs). HDACs odstraní acetylskupinu, která je nahrazena methyl skupinou za účasti HMTs (Suv39H1- human, Clr4 ­ S.pombe) 2004: Objev demethylace histonů za účasti amin oxidasy LSD1 (KIAA0601) (Shi et al., Cell 2004). LSD1 specificky demethyluje H3 (K4), epigenetickou modifikaci zodpovědnou za transkripční aktivitu. HATs: HAT1, PCAF, CBP/p300, TFIIC90 (according Allis et al., 2007) HDACs: Class I, II, III HMTs: Suv39H1, G9a, MLL1, Set 1, Set 2 Demethylases: LSD1, JHDM1a, JHDM2a, JMJ D2B HMTs: D. melanogaster: Su(var)3-9 je lokalizován v oblastech kondenzovaného chromatinu a je to klíčový regulátor v organizaci represivního chromatinu. homolog u S.pombe je Clr4 umyší SUV39h1 a u lidských buněk SUV39H1. Tyto HMTs specificky methylují H3(K9). CD: protein-chromatin CSD: protein-protein HD: HP1-to-DNA and linker histones Primárním důsledkem histonových modifikací je snížení schopnosti histonových konců interagovat s dalšími složkami chromatinu, včetně DNA. Activity Inactivity Ikaros, Helios Amino acid Ubiquitination of histones has been reported in vivo although the most prevalent ubiqutination occurs in H2A and H2B. One of the widely studied proteins that undergoes ubiquitination for its activity is p53. TRANSKRIPČNÍ AKTIVACE: H3-R2-Me, H3- Ac-K9, H3- K27Me (Xi), H3-K36-Me, H3- K79-Me (telomeric silencing), H4-K20-Me (mitotic condensation) TRANSKRIPČNÍ INAKTIVACE: H3-Me-K9, H3-S10-P, H3-K17Ac, H3- R-17-Me, H3-K18-Ac, H3-K23-Ac, H4-R3-Me, H4-K8-Ac, Repression of cyclin E promoter MeCP2: Methyl-CpG binding Protein, specifically binds to to methylated DNA INAKTIVITY IMPRINTING Myší embryo: samičí alela je zamethylována, nevyjadřuje se Dospělý jedinec: obě alely jsou demethylovány Gametogeneze: se obnoví původní stav Platí pro gen IGF II. ISSN1471-0056 ˇ Centromeric heterochromatin: mono- or di-meH3-K9 * Pericentric heterochromatin: tri-meH3K9 * Euchromatin: di-meH3-K4 and Acetylated * Xi is -4x-methyl H3(K9) ˇMethylation of H3(K9), H3(K27) and H3(K20) are associated with the repressive chromatin state whereas H3(K4), H3(K36) and H3(K79) methylations and/or histone acetylation have been correlated with active chromatin (summary Fischle et al., 2003; Lachner et al., 2003). Methylation state of centromeres Chadwick nad Willard, PNAS, 101, p.17450-17455 Inaktivace X chromosomu ve vztahu k epigenetickým modifikacím Inaktivace X chromosomu ve vztahu k epigenetickým modifikacím Methylation state of telomeres -4x-methyl H3(K9) FAKULTATIVNÍ HETEROCHROMATIN Polycomb group (PcG) proteins are highly conserved regulatory factors that were initially discovered in Drosophila. PcG genes are best known for their role in maintaining silent expression states of Hox genes during development, while trithorax group (trxG) proteins maintain Hox gene expression patterns in the appropriate spatial domains. PcG and trxG proteins are also involved in the regulation of normal cell proliferation, and their mutation has been linked to defects in stem cell fates and to cancer. They act by regulating chromatin structure and chromosome architecture at their target loci. 2006: Genome-wide mapping of the down-stream target sites for PcG proteins HP1 proteins ˇHP1 proteiny jsou hlavní složkou heterochromatinu a hrají důležitou úlohu při jeho tvorbě. HPs jsou mají vysokou afinitu k pericentromerickým a telometrickým oblastem chromosomů. * HPs interagují s HMTs jako je SUV39h, která je zodpovědná za methylaci H3(K9). HP1 proteins: 1. Heterochromatin protein (dHP1) was first identified in Drosophila and shown to localise to heterochromatin by antibody staining. 2. Mutation of HP1 gene decrease the effect of PEV (position effect variegation) on gene expression. 3. Null mutations of HP1 are lethal due to chromosome loss during cell division. 4. Homologous protein to HP1 are these of Polycomb group (Pc). Both Pc and HP1 share a common amino acid sequence of the chromodomain (chromatin modification) which is thought to mediate protein/protein interactions. This domain is highly conserved from yeast to man. 5. Three genes for mammalian HP1 have been identified: , , and . 6. To date only and HP1 proteins have been identified in Xenopus laevis. We want to determine the role of HP1 proteins in Xenopus development. Chromo domain Hinge Chromo - Shadow HPs se skládají z vysoce konzervativních oblastí: a) N-terminální chromodomény (CD) b) strukturálně odvozené C-terminální chromoshadow domény (CSD) FUNKCE HPs a) Uspořádání chromatinu b) Regulace transkripce c) Optimální regulace délky telomer a zprostředkování procesu telomeric silencing Hayakawa et al., 2003 HP1 proteiny ­ v lidských buňkách jsou 3 sub-typy Savčí jádra obsahují 10-30 sférických struktur zvaných PML bodies (PODs, ND10 nebo Kremer bodies). Gen kódující PML je fúzován s genem kódujícím receptor pro kyselinu retinouvou a to u akutní promyelocytické leukemie (APL), Jde o translokaci t(15;17). PML bodies jsou cílem mnoha virů při časné infekci, jsou místem iniciace transkripce u virů. PML bodies interagují s mnoha proteiny podobnými HDAC, které se však neshromažďují v PML bodies. PML jsou zahrnuty v řadě procesů jako je buněčný růst, apoptóza, imunitní odpovědi a regulace transkripce. PML jsou také místem degradace některých proteinů, asociují nejen s HP1, ale i se specifickými geny jako je p53 a jeho protein TP53. PML NBs obsahují nově syntetizovanou RNA, výsledkem je významná úloha PML bodies v regulaci genové exprese. Neuronal cell differentiation of EC cells - HP1 proteins HP1 HP1 Taddei et al., 2001 TIF1 beta and chromocentres and HP1 protein H3(K4) di-methylation and IC spaces HP1 Cen 14/22HP1 H3K9 me2 H3K4 me2 SHRNUTÍ Ligation mediated PCR Centrum základního výzkumu proCentrum základního výzkumu pro monoklonálnímonoklonální gamapatiegamapatie a mnohočetnýa mnohočetný myelommyelom LC 06027LC 06027 Cancer susceptibility gene 1 Shrnutí problematiky 1. Organizace chromatinu, struktura nukleosomů 2. Varianty histonů 3. Epigenetické modifikace histonů a jejich funkce 4. Epigenetické modifikace centromer, Xi a telomer 5. HP1 proteiny ­ struktura a funkce 6. Účinky HDACi 7. Methylace DNA versus methylace histonů