562 VESMÍR 79, říjen 2000 l http://www.cts.cuni.cz/vesmir
2 3 4 5 6
1. Nově replikovaná DNA lidské buňky HeLa značená modifikovaným
nukleotidem. Buněčné jádro v pozdní fázi S buněčného cyklu je
narušeno působením detergentu. Z obrázku je patrná původní akumulace
DNA v několika stech jaderných replikačních center i rozvinutá
DNA po uvolnění proteinových složek chromatinu působením
detergentu. Lineární značené úseky jsou zvláště patrné vně jádra
a odpovídají plně natažené dvojšroubovici DNA. Tímto způsobem lze
měřit délku replikonu a rychlost replikační vidličky (za laskavé poskytnutí
obrázku děkuji Dr. J. Malínskému). Měřítko 10 m.
2. Výsledek fluorescenční hybridizace in situ (FISH) v diploidní lidské
buňce se sondami specifickými pro lidský chromozom 1. V jádru
jsou patrna dvě chromozomální teritoria. (Za laskavé poskytnutí obrázku
děkuji Dr. I. Melčákovi.)
1
http://www.cts.cuni.cz/vesmir l VESMÍR 79, říjen 2000 563
Buněčné jádro popsal před více než 150 lety R. Brown.
Dnes se o něj zajímají vědecké laboratoře po celém
světě. Zájem samozřejmě pramení z toho, že jsou
v jádře uloženi nositelé dědičné informace, chromozomy.
Zároveň je výzkum jádra zajímavý proto, že je
postaven před několik zásadních problémů. Žijeme
v éře genomiky, pořadí nukleotidů v jednotlivých lidských
chromozomech je již v podstatě stanoveno a na
základě této znalosti můžeme určit detailní uspořádání
genů. Víme však stále velmi málo o tom, jak jsou
chromozomy v jádře organizovány. Význam genomiky
je nezastupitelný, současně je však nutné si uvědomit,
že jaderné procesy neprobíhají ve zkumavce,
ale v rámci jaderné architektury, která se vyvíjela po
miliony let.
Jak je možné, že jsou asi 2 m DNA v lidské buňce
poskládány do jádra o průměru 10 m? Navíc DNA
musí být nejen uskladněna, ale během buněčného
cyklu i zdvojena (replikována) právě jen jednou, a to
pod bedlivým dohledem mechanizmů zaručujících
její bezchybné uchování. Poskládat DNA do jádra je
jako uložit 2000 km dvoumilimetrového ,,vlasce" do
běžného obývacího pokoje v paneláku. Lidská somatická
buňka však obsahuje 23 párů chromozomů
s různým množstvím DNA (chromozomy mají různou
velikost). V obývacím pokoji je tedy uloženo 46 více
či méně rozmotaných obrovských ,,špulek" vlákna!
Z vlastní zkušenosti vím, že rozplést několik metrů
Buněčné jádro
Jak vyrobit protein
a nezamotat se
IVAN RAŠKA
Prof. RNDr. Ivan Raška, DrSc., (*1945) viz Vesmír 79, 24, 2000/1
zamotaného rybářského vlasce je svízelné, buněčné
jádro to však musí zvládnout velmi rychle. Pokoj (jádro)
je vlascem (DNA) doslova přeplněn, neboť je
v komplexu s proteiny, jimž ve srovnání s vlascem
přísluší asi dvojnásobný objem. Výsledný nukleoproteinový
komplex, zvaný též chromatin, sám o sobě
zabírá desítky kubických metrů prostoru obývacího
pokoje (viz Vesmír 77, 390, 1998/7). Jak je vůbec
v tak složitém prostředí organizován přepis určitého
genu? A jak je to s navazujícími jadernými procesy
genové exprese, zahrnujícími vyzrávání a úpravy
molekul RNA (viz rámeček na této straně)?
Genová exprese
Připomeňme si zde základní etapy vyjádření genu
(genové exprese) v jádře. Jeho první úrovní je transkripce
­ syntéza RNA podle předlohy DNA. Výsledkem
je tzv. primární transkript. Transkripce se
účastní několik desítek bílkovin v tzv. transkriptozomovém
komplexu a ovlivňuje ho mimo jiné řada
,,návěstí" na samotné molekule DNA, například promotorová
sekvence, na kterou nasedá RNA-polymeráza,
a různé další regulační oblasti. Tyto úseky zpravidla
nejsou součástí přepisované sekvence DNA.
Další stupeň genové exprese představuje vyzrávání
primárního transkriptu spojené s jeho úpravami.
Část informace obsažené v sekvenci vyzrálé mRNA
je v cytoplazmě přeložena do sekvence aminokyselin
v polypeptidovém řetězci. (Podrobněji se genovou
expresí zabývá tabulka na s. 570­571.)
POTÍŽE PŘI STUDIU JADERNÝCH PROCESŮ
Většina faktorů, které provádějí a regulují procesy replikace,
transkripce a vyzrávání RNA, není dostatečně jedinečná.
Např. skladba transkripční mašinerie přepisující
geny aktinu a myozinu či jiných genů je často
v prvním přiblížení identická. Svým způsobem lze říci,
že jedinečnost je dána především pořadím nukleotidů
v genu, respektive příslušné RNA.
K pochopení jaderných funkcí se používalo tří různých
metodik v podstatě neprovázaných vědních disciplín.
Biochemici a molekulární biologové se zabývali mechanizmy
biochemických reakcí, které analyzovali v bezbuněčných
podmínkách in vitro. Genetici se snažili izolovat
mutanty ovlivňující jadernou funkci a analýzou výsledného
fenotypu odvozovali funkci daného proteinu
či proteinů in vivo. A konečně strukturní biologové včetně
morfologů popisovali, ať na molekulární či jaderné
úrovni, strukturní změny za různých podmínek a odvozovali
funkci jaderných makromolekul či kompartmentů.
Částečně již v 80. letech a naplno teprve v letech 90.
se všechny tři vědní disciplíny propojily a molekulárněbuněční
biologové různé přístupy kombinují. To vše bylo
doprovázeno rozsáhlým pokrokem v přístrojovém vybavení
a metodách, jako jsou např. konfokální mikroskopie
(viz Vesmír 74, 508, 1995/9) a neizotopová hybridizace
in situ. A v tomto pozitivním smyslu prošly v 90. letech
naše vědomosti o struktuře a funkci jádra ,,velkým
třeskem". I. R.
3. Obraz chromozomálního teritoria získaný jiným způsobem než
na obr. 2. Do kultivačního média synchronizované buněčné kultury
je po dobu celé fáze S (buněčný cyklus viz obr. 7) přidáván modifikovaný
nukleotid, bromodeoxyuridin (BrdU), který je DNA-polymerázou
začleněn do DNA místo deoxythymidinu. Nepoužitý BrdU je posléze
vymyt a buněčná kultura projde 5 buněčnými cykly, během
nichž se chromozomy obsahující značenou DNA náhodně oddělují.
Po 5 cyklech buněčné jádro obvykle obsahuje jen jeden nebo dva
chromozomy značené BrdU. V imunofluorescenčním obraze s protilátkou
proti BrdU vykazují teritoria jemnou strukturu v podobě subchromozomálních
domén. (Za laskavé poskytnutí obrázku ­ konfokálního
řezu ­ děkuji Mgr. M. Eltsovovi a Mgr. V. Čtrnácté.)
4. Jadérko značené protilátkou proti bílkovině fibrilarinu (červeně)
a Cajalovo tělísko značené protilátkou proti proteinu p80-coilinu (zeleně).
Cajalovo tělísko také obsahuje fibrilarin (signál v Cajalově tělísku
je nažloutlý; kdyby zde fibrilarin nebyl obsažen, signál by měl
výlučně zelenou barvu). To svědčí o tom, že Cajalova tělíska plní
i obdobnou úlohu jako jadérko. (Za laskavé poskytnutí obrázku děkuji
slečně L. Tomšíkové a slečně S. Ryšavé.)
5. Současné značení jaderných skvrn protilátkou proti bílkovině SC35
(červeně) a Cajalova tělíska protilátkou proti proteinu p80-coilinu (zeleně).
SC35 je zkratka důležitého sestřihového proteinu SR. Cajalovo
tělísko faktor SC35 neobsahuje. (Za laskavé poskytnutí obrázku
děkuji panu J. Fisherovi.)
6. Fluorescenční obraz jádra, v němž byla detegována Cajalova tělíska
(šipky) a tělíska PML.
Poděkování autora: Článek je společným dílem pracovníků Laboratoře
buněčné biologie, Ústavu experimentální medicíny AV ČR
a Laboratoře genové exprese 3. Lékařské fakulty UK, kterým vzdávám
dík. Mimo to chci poděkovat prof. K. Raškovi, dr. K. Kobernovi,
dr. J. Malínskému a dr. D. Staňkovi za připomínky k článku, dr. J.
Malínskému a panu J. Fischerovi za úpravu obrázků. Část mikroskopické
dokumentace jsme zpracovali na konfokálním mikroskopu
UK v Plzni, zde patří dík prof. J. Reischigovi a firmě Olympus.
Vznik článku byl podpořen granty Wellcome Trust 049949/Z/97/
Z/JMW/JPS/CG, Grantové agentury České republiky 302/99/0587
a 304/00/1481 a MŠMT VS 96129.
GRANTOVÁAGENTURAČRPŘEDSTAVUJE
s
s
564 VESMÍR 79, říjen 2000 l http://www.cts.cuni.cz/vesmir
Genová exprese samozřejmě zahrnuje i návazné
kroky, především transport mRNA do cytoplazmy,
úpravy syntetizované bílkoviny a její nasměrování do
cílového působiště (ať již uvnitř či vně buňky), které
je často doprovázeno její chemickou modifikací, např.
glykosylací nebo vyštěpením směrovacích signálů (viz
Vesmír 79, 24, 2000). Množina přítomných proteinů
a druh jejich modifikace určují funkční uspořádání
příslušného buněčného kompartmentu (obr. 9).
Členění (kompartmentace) buněčného jádra
Buněčné jádro představovalo ještě před patnácti lety
pro řadu biologů útvar, kde ,,v moři chromatinu plave
jadérko". Zcela odlišný obraz jádra však získáváme
dnešními imunocytochemickými nebo hybridizačními
přístupy (viz rámeček na této straně) při detekci
jaderných bílkovin, genů nebo RNA. Mnoho těchto
makromolekul je lokalizováno do zřetelně odlišitelných
jaderných oblastí či domén. Jádro je tedy strukturně
členěno ­ kompartmentováno (obr. 8 a 10).
Chromatinové struktury do značné míry zaplňují
jádro. Zbývající prostor jádra se nazývá interchromatinový
prostor či interchromozomální systém
kanálů. RNA je syntetizována na povrchu chromatinových
struktur a po ukončení syntézy je uvolňována
do interchromatinového prostoru. V něm se také
sestavují multienzymové komplexy, zajišťující např.
transkripci (transkriptozomy) či sestřih (spliceozo-
my).
V interchromatinovém prostoru se odehrává metabolizmus
RNA a nacházíme v něm řadu jaderných
tělísek a domén ­ především jadérko (obr. 4); dále
pak Cajalova tělíska, tělíska PML (promyelocytic
leukemia), jaderné skvrny (obr. 4, 5 a 6) a několik
dalších. S výjimkou jadérka dosud neznáme přesnou
funkci žádného z nich.
DNA, chromatin a chromozomy
DNA je v buněčném jádře přítomna v komplexu
s bazickými proteiny histony a nehistonovými bílkovinami
ve formě chromatinu. Vzhledem k své délce
je v chromatinu poskládána hierarchickým způsobem
(viz Vesmír 77, 390, 1998/7). Nejvíce je kondenzována
v mitotickém chromozomu. Interfázní
chromatinová struktura je naopak více či méně rozvolněna
(buněčný cyklus a pojmy s ním spojené vysvětluje
obr. 7). Detailně známe pouze nejnižší stupeň
interfázní hierarchie, tzv. nukleozomální uspořádání
chromatinu neboli 10nm chromatinové vlákno.
V něm jsou zhruba dvě otočky dvojšroubovice
DNA svinuty do nukleozomu, obsahujícího histony.
Svinutím 10nm vlákna vzniká vlákno 30nm. Jeho
existence je obecně akceptována, jeho přesná struktura
však není známa. Otázkou zůstává způsob poskládání
30nm vlákna do chromatinových struktur
vyšších řádů, chromozomálních smyček anebo chromonemových
vláken, ač se v učebnicích pravidelně
setkáváme s různými spekulativními schématy. Víme
však, že chromatinové struktury jednotlivých chromozomů
nejsou navzájem promíchány a vytvářejí
uvnitř jádra oddělená chromozomální teritoria (obr.
2 a 3). Existuje rovněž řada poznatků o tom, že vzájemné
uspořádání chromozomálních teritorií v jádře
není zcela náhodné a že transkripční aktivity jsou
lokalizovány na povrch chromozomálních teritorií
(resp. na povrch subchromozomálních domén; obr.
2 a 3).
Aby určitý gen mohl být přepsán RNA-polymerázou,
musí mít polymeráza k sekvenci DNA přístup,
kompaktnost chromatinové struktury musí být narušena.
Přesný způsob a rozsah rozvolnění chromatinu
však není v běžné (např. lidské) buňce znám.
(Výjimku tvoří např. štětkovité chromozomy ve vajíčkách
obojživelníků. Hledat však plnou analogii
mezi speciálními případy a diploidní somatickou savčí
buňkou může být zavádějící.)
V nejbližší době patrně dojde ke zvratu v poznání
vyšších řádů organizace chromatinu, resp. chromozomů.
Naznačuje to např. nedávný objev rozsáhlé
rodiny proteinů SMC (Structural Maintenance of
Chromozomes), které se podílejí na utváření jak mitotických
chromozomů, tak interfázního chromatinu
a také na metabolizmu DNA včetně jejích oprav.
Obrovského pokroku bylo dosaženo ve strukturním
popisu lokálního uspořádání chromatinu na úrovni
10nm vlákna. Mluví se o remodelaci chromatinu, ať
již ve smyslu aktivace nebo represe transkripce, či ­
JÁDRO V RUKOU BIOLOGŮ
V současné době ovládla světelnou mikroskopii fluorescenční
imunocytochemie, respektive fluorescenční hybridizace
in situ (FISH). V imunocytochemii využíváme vysoké
vazebné síly protilátky vůči antigenu, zpravidla proteinu.
Místo, na něž se tato ,,primární" protilátka váže,
detegujeme sekundární protilátkou (tj. protilátkou proti
protilátce) s kovalentně navázaným fluorochromem
(např. fluoresceinem, rhodaminem nebo v současné
době hojně využívanými cyaninovými fluorochromy). Ve
FISH místo primární protilátky používáme sondu nukleové
kyseliny, v níž je sekvence nukleotidů v délce zpravidla
několik desítek až stovek nukleotidů komplementární
k sekvenci DNA či RNA, kterou chceme v buňce detegovat.
V podstatě ve FISH probíhá obdobná reakce jako
při vazbě antiparalelních řetězců v dvojšroubovici DNA.
Sonda ovšem musí obsahovat specifickou značku, modifikovaný
nukleotid, vůči kterému máme k dispozici protilátku
s navázaným fluorochromem. Samozřemě lze současně
použít imunocytochemii a FISH (viz obrazové přílohy
na s. 562 a 569). Ve fluorescenčním mikroskopu
osvítíme preparát dlouhovlnným UV-světlem, a tím přimějeme
fluorochromy, aby vyzářily světlo ve viditelné
oblasti spektra. Protože různé fluorochromy vyzařují ve
vymezených vlnových délkách, lze současně detegovat
několik různých antigenů či sekvencí nukleových kyselin
(např. v červené, žlutozelené či fialové barvě). Imunocytochemické
a FISH přístupy zpravidla (naštěstí ne
vždy, viz některé dokumentované obrázky replikace
a transkripce či použití hybridních proteinů GFP) vypovídají
o rovnovážné distribuci makromolekul. Studujeme-li
nějaký buněčný proces, detegujeme v rámci tohoto
procesu jeho nejpomalejší kroky. Třeba při rychlosti
eukaryontní RNA-polymerázy řádově asi 1000 nukleotidů
za minutu může přepsání delších genů (např. gen
dystrofinu) trvat desítky minut, ba i hodin (viz též článek
E. Dráberové, Vesmír 79, 438, 2000/8). I. R.
bunný
cyklus
interfá
ze
fáze G1
fázeG2
fáze
S
mitóza
7. Jednotlivé fáze
buněčného či lépe
jaderného cyklu eukaryont.
Na základě
optického pozorování lze
rozlišit fázi mitózy, kdy
mateřské jádro dává
vzniknout dvěma novým
jádrům, a interfázi, údobí
mezi dvěma mitózami.
Interfáze bývá dále
rozdělována na období
před počátkem replikace
DNA, tzv. fázi G1, období
replikace, označované
jako fáze S, a období mezi
replikací a mitózou, zvané
G2. Na konec fáze M
obvykle navazuje dělení
buňky.
GRANTOVÁAGENTURAČRPŘEDSTAVUJE
http://www.cts.cuni.cz/vesmir l VESMÍR 79, říjen 2000 565
řečeno trochu jinak ­ o aktivním vlivu struktury
chromatinu na genovou expresi, přičemž nejdiskutovanějšími
ději jsou dnes acetylace a deacetylace
histonů, popř. metylace a demetylace DNA. DNA-polymeráza,
RNA-polymerázy a celá paleta regulačních
proteinů jsou cílově nasměrovány genově specifickými
regulátory a vyvolávají lokální změnu v uspořádání
chromatinu, která se projevuje dvojí možností
funkce, buď transkripcí, nebo replikací (obr. 8 a 10).
Chybné nasměrování těchto a jiných enzymů a regulačních
faktorů vede k nežádoucím změnám buněčného
metabolizmu.
Genom člověka obsahuje řádově 100 000 genů.
Jejich délka činí jen několik málo procent celkové
délky DNA v genomu. Navíc se v diferencované buňce
exprimuje jen část genů. Cytogenetici vypracovali
detailní mapy mitotických chromozomů pomocí cytochemických
pruhovacích metod (obr. 8; viz rovněž
Vesmír 70, 326, 1991/6). Modifikovaným barvením
podle Giemsy vznikají na mitotickém chromozomu
rovnoběžné G-pruhy, kolmé k delší chromozomální
ose. Při jiném barvení vznikají komplementární
R-pruhy. Zatímco R-pruhy odpovídají v interfázi spíše
rozvolněnějšímu chromatinu (euchromatinu)
a jsou v nich umístěny geny, G-pruhy odpovídají
v interfázi kondenzovanějšímu, transkripčně neaktivnímu
chromatinu ­ heterochromatinu ­ a jsou
v nich lokalizovány hlavně nekódující sekvence DNA.
V mitotickém chromozomu se střídají části, které
jsou v interfázi aktivní a neaktivní. V interfázi se
v rámci jednoho chromozomálního teritoria aktivní
a neaktivní části genomu prostorově oddělují. Aktivní
oblasti chromozomálního teritoria se nacházejí spíše
,,uvnitř" jádra, neaktivní na jeho periferii. Tento
nález má zásadní význam, neboť svědčí o pohybu
a reorganizaci interfázního teritoria vzhledem
k uspořádání chromozomu mitotického. V tomto
9. Značná část obsahu článku je obsažena v tomto schématu, které
popisuje dva vybrané příklady nového jaderného uspořádání makromolekul
související s podstatou jaderné kompartmentace (viz rovněž
obr. 10). Požadavek pro interakci, a tudíž zabudování makromolekuly
do nějaké jaderné struktury, nezávisí jen na strukturním motivu
pro interakci, ale také na síle interakcí ostatních částí makromolekuly,
jež jsou zprostředkovány jinými strukturními motivy. V tomto
případě se může stát, že je makromolekula na základě dvou strukturních
motivů kompartmentována do dvou různých struktur. Panel a
ukazuje základní fyziologický stav uspořádání jaderných složek ve
dvou různých kompartmentech. Panel b znázorňuje nové uspořádání
makromolekuly způsobené přítomností jiné (např. nově syntetizované)
makromolekuly s vyšší vazebnou afinitou. Panel c je příkladem
obměny strukturního motivu, např. fosforylací či defosforylací
pomocí proteinkináz a fosforyláz. V tomto případě je výsledkem stejné
uspořádání jako v předchozím případě. Za důležitou považuji tu skutečnost,
že interakce v daném komplexu makromolekul mohou být
řízeny faktory, které jsou vyvázány v jiné, prostorově ,,vzdálené" struktuře
(kompartmentu). Jinými slovy to znamená regulaci na dálku! Tento
regulační aspekt nelze vhodným způsobem postihnout v podmínkách
in vitro, kde jsme schopni analyzovat do detailů jeden proces,
ale nemůžeme dost dobře zároveň sledovat i další proces, odehrávající
se na jiné struktuře. Potřebujeme k tomu kontext celého jádra,
resp. celé buňky. To jen podtrhuje důležitost molekulární buněčné
biologie. (Ze společné práce s dr. I. Melčákem.)
a
b
c
bunné
jádro
chromozomální
teritorium
interchromatinový
prostor
asn
replikovaná
DNA
pozdn
replikovaná
DNA
Cajalova
tlíska
jadérko
jaderné
skvrny
a
b c
d
e
8. a ­ Zjednodušené schéma jádra s interfázními chromozomy (chromozomálními teritorii)
a nejznámějšími kompartmenty interchromatinového prostoru. b ­ Detail jednoho chromozomálního
teritoria, v němž je znázorněno rozložení časně a pozdně se replikující DNA. c ­
Časně a pozdně se replikující sekvence DNA v pruzích R a G mitotického (tj. maximálně
,,sbaleného") chromozomu. d ­ Model vyššího uspořádání interfázního chromozomu na
bázi chromozomálních smyček. e ­ Model vyššího uspořádání interfázního chromozomu
na základě euchromatinizovaného chromonemového vlákna (viz rovněž obr. 18).
GRANTOVÁAGENTURAČRPŘEDSTAVUJE
566 VESMÍR 79, říjen 2000 l http://www.cts.cuni.cz/vesmir
ohledu také není struktura teritoria homogenní, je
složena ze subchromozomálních domén (obr. 3)
a svědčí o částečném rozvolnění chromatinových
struktur. Někteří autoři mluví dokonce o doménách
s velikostí 400 až 800 nm, z nichž je teritorium vytvářeno.
Objem interfázního chromozomu je přitom
závislý na počtu jeho aktivních genů, tj. na zvýšení
povrchu teritoria čili na rozsahu rozvolnění (euchromatinizace)
chromatinu. Čím je počet aktivních
genů vyšší, tím větší prostor teritorium zaujímá. Klasickým
příkladem je srovnání aktivního a inaktivního
X-chromozomu v lidské buňce ženského pohlaví (viz
rovněž obr. 18).
Uspořádání chromatinu je důležité z hlediska replikace
DNA. Vznikají při ní dvě dvojšroubovice, každá
se skládá z jednoho řetězce původního a jednoho
nově syntetizovaného (obr. 11). Miliardy nukleotidů
lidské DNA jsou během několika málo hodin věrně
zdvojeny. Jestliže si představím výše uvedenou analogii
s vlascem, je to pro mne něco nemyslitelného.
Před zahájením vlastní replikace nejprve vznikají
prereplikační komplexy. Vlastní replikační komplex
zahrnuje desítky dalších proteinů, od DNA-polymeráz
až po enzymy, které přestřihnou a znovu spojí
vlákna DNA. Ty také alespoň zčásti řeší, jak by se
mohly bezchybně prostorově oddělit dceřiné řetězce
DNA. Konečný výsledek se projeví až během mitózy
oddělením dceřiných DNA do dvou identických chro-
matid.
DNA-polymerázy eukaryontní buňky začleňují do
nově vznikajícího řetězce DNA řádově jen asi 1000
nukleotidů za minutu. Je proto nutné, aby syntéza
DNA probíhala současně na mnoha místech každého
chromozomu. Vznikají stovky až tisíce replikačních
jednotek, replikonů. Aktivita replikonu je ukončena
v okamžiku, kdy replikační vidlička narazí na
vedlejší aktivní replikon, popř. na již duplikovaný
úsek DNA nebo na úsek DNA, který má být replikován
později. Na buněčné úrovni vznikají replikační
domény či ohniska (obr. 1, 14­16), přičemž každé
z nich obsahuje jeden nebo několik, zpravidla sousedících
replikonů. Replikony jsou dlouhé v průměru
100 000 nukleotidů, ale připouští se existence
i replikonů mnohonásobně delších. Někteří autoři
spekulují, že replikační ohniska odpovídají výše popsaným
subchromozomálním doménám. Za důležitý
nález považuji skutečnost, že na počátku fáze
S buněčného cyklu se jako první začínají replikovat
především sekvence genů aktivních v předcházející
fázi G1. To je snad usnadněno rozvolněnou strukturou
chromatinu a faktory, které jsou přítomny
v transkriptozomu a současně hrají úlohu při replikaci.
V pozdní fázi S se replikují sekvence, které tvoří
G-pruhy mitotického chromozomu.
Subchromozomální domény nás přivádějí k dalšímu
biologickému problému. Regulační sekvence
genu totiž nestačí k zajištění jeho exprese, která vyžaduje
přítomnost mnohem delších specifických úseků
DNA. Ukazuje se, že chromatin je organizován
do nezávislých jednotek genové aktivity uspořádaných
do menších či větších subchromozomálních
domén a vymezených specifickými hraničními elementy.
Ty izolují gen od vlivu sousedních sekvencí
DNA. Nejpropracovanější modely této vyšší funkční
organizace chromatinu jsou jednak locus control region
(LCR) u savců, jednak special chromatin structures
(scs a scs') u drozofily (obr. 17).
Na tomto místě je vhodné se zmínit o modelu euchromatinizovaných
chromonemových vláken,
která obsahují genové úseky lokalizované do R-pruhů.
Na dlouhé sekvence obsahující aktivní geny (řádově
miliony nukleotidů, čili množství DNA obsažené
v jednotlivých pruzích mitotického chromozomu)
jsou navázány regulační faktory (včetně např. acetyltransferáz).
Vazba těchto faktorů pak vede k rozvolnění
lokální chromatinové struktury, k euchromatinizaci.
Ta dále indukuje rozvolňovací aktivitu
i v sousedním chromatinu obsahujícím neaktivní
geny a euchromatinizace se šíří po délce DNA odpovídající
v mitóze R-pruhu. Taková interpretace je
patrná z obr. 18a a 18b a ukazuje rovněž na přímý
vliv změn lokální struktury chromatinu (na úrovni
10nm vlákna) na chromatinové struktury řádů vyš-
ších.
Jak by se mohlo zdát, pro život buňky je důležitá
jen ta malá část genomu, která obsahuje geny. Jakou
funkci ale hrají zbylé sekvence lidské DNA, skládající
se z mnohonásobně se opakujících identických
či skoro identických kratších či delších úseků, nefunkčních
duplikovaných genů apod.? V posledních
letech již bylo prokázáno, že neaktivní heterochromatin
sám o sobě hraje důležitou úlohu v genové expresi.
Jestliže je aktivní gen, který se původně nachází
v euchromatinu, přemístěn do heterochromatinové
oblasti, jeho exprese je potlačena. Tento vliv
polohy genu v rámci chromozomu (chromatinu) na
jeho expresi je nejrozsáhleji propracován u drozofily
a v menší míře i u savců. Např. transkripční regustrukturní
motivy
alternativní
interakce
genom
genová exprese kompartmentace
regulace
externí faktory
10. Zjednodušené schéma dokumentující vztah mezi genomem (genovou
expresí) a jadernou kompartmentací. Domnívám se, že za kompartmentaci
je odpovědná genetická informace a její exprese, a to
prostřednictvím specifických strukturních motivů v jaderných složkách
(proteinech, RNA či DNA; viz obr. 8). Kompartmentace ovlivňuje
genetickou informaci (genovou expresi) skrze prostorové přemístění
potřebných faktorů. Genová exprese zpětně moduluje kompartmentaci.
Nicméně kompartmentace může být ovlivněna i prostřednictvím
jiných strukturních motivů. Vnější podněty (např. pokusy
s umělou infekcí, viry, hormony, inhibitory transkripce, tepelný šok)
ovlivňují jak genovou expresi, tak kompartmentaci a mohou spustit
jiné dráhy v interakcích. Výsledkem je jak pozměněná genová exprese,
tak kompartmentace. Tyto nové dráhy jsou doprovázeny menšími,
ale často i zcela zásadními změnami v jaderné architektuře (viz
např. obr. 23). (Ze společné práce s dr. I. Melčákem.)
rodiovská
dvojšroubovice DNA
smr pohybu
replikaní vidliky
nov
syntetizované
etzce
11. Schéma replikační vidličky vznikající při syntéze DNA
GRANTOVÁAGENTURAČRPŘEDSTAVUJE
http://www.cts.cuni.cz/vesmir l VESMÍR 79, říjen 2000 567
látor Ikaros se uplatňuje během diferenciace lymfoidních
buněk. Zatímco sledované aktivní geny jsou
součástí euchromatinu, pohyb genů jádrem do heterochromatinové
oblasti, v níž je přítomen Ikaros,
je doprovázen inaktivací (umlčením) genů (obr. 21).
Z uvedeného vyplývá další aktivní úloha chromatinu:
nejen umožnit regulovanou genovou expresi prostřednictvím
euchromatinu, ale též ­ prostřednictvím
heterochromatinu ­ zamezit nechtěným interakcím.
Jadérko
Biosyntéza ribozomů se odehrává v jadérku, které
se vytváří v místech odpovídajících v mitóze chromozomálním
organizátorům jadérka (nucleolar organizer
regions ­ NOR), tedy těm oblastem DNA, kde jsou
umístěny geny pro ribozomální DNA (rDNA). V lidské
diploidní buňce se v organizátorech 10 chromozomů
vyskytuje asi 400 genů a každý organizátor obsahuje
mnoho genů uspořádaných za sebou. Ne vždy
jsou všechny organizátory v interfázi aktivní
a i několik aktivních organizátorů může být součástí
jediného jadérka. V lidské buňce nacházíme zpravidla
jedno až tři jadérka. Transkripční aktivita zjevně
vede k vytvoření stabilně fungujícího jadérka
v interfázi. Při mitóze se transkripce utlumuje, jadérko
se rozpadá do malých tělísek, která po mitóze
ihned splynou v místě organizátoru a vytvoří nové
funkční jadérko. Některé složky jadérka, např. RNApolymeráza
I, zůstávají během mitózy asociovány
s organizátorem na chromozomu. To vše svědčí
o tom, že buňka je dobrým hospodářem. Využije části
rozpadlých jadérek a je schopna okamžitě po mitóze
začít s výrobou ribozomů. Vysoce ekonomicky se
ostatně buňka chová i v případě syntézy RNA mimo
jadérko.
Tvorba ribozomu je komplexní proces zahrnující
transkripci (obr. 19 a 20) 45S prekurzorické rRNA,
její vyzrávání, modifikaci a rovněž asociaci rRNA
s ribozomálními proteiny a 5S rRNA, která se syntetizuje
mimo jadérko (podrobně na s. 570­571).
Vyzrávání rRNA se účastní mnoho proteinových faktorů
a snRNA v komplexu, jemuž se říká procesozom.
Zmíněné snRNA jsou vzhledem k své lokalizaci
nazývány malé jadérkové RNA (snoRNA) a obsahují
funkčně důležité sekvence.
Ač byla funkce jadérka v biosyntéze ribozomů popsána
na počátku 60. let, dosud není známo, jakým
způsobem jsou ribozomální částice dopravovány
z jadérka do cytoplazmy. Mezi další možné funkce
jadérka lze zahrnout:
n účast v jaderném importu a exportu, včetně exportu
a degradace mRNA;
n účast v biosyntéze SRP (Signal Recognition Particle
­ viz Vesmír 79, 24, 2000) a telomerní RNA (telomery
jsou konce chromozomů; v interfázi jsou telomerní
sekvence součástí heterochromatinu);
n hromadění důležitých makromolekul (např. faktorů
regulujících buněčný cyklus), což jim zabraňuje
plnit jejich funkce;
n účast na vyzrávání některých snRNA a tRNA.
Syntéza RNA mimo jadérko a její sestřih
Transkripce probíhá na povrchu chromatinových
struktur v perichromatinové oblasti interchromatinového
prostoru. Většina primárních transkriptů
obsahuje introny, které musí být vystřiženy před
transportem RNA do cytoplazmy, přičemž vystřižené
introny jsou zpravidla rychle rozloženy. K sestřihu
dochází často souběžně s transkripcí, ještě když je
syntetizovaná RNA spojena s místem transkripce. Je
však známo, že část prekurzorických RNA obsahuje
introny i polyadenylovaný konec, jenž ale vzniká až
po ukončení syntézy primárního transkriptu. Některé
molekuly RNA proto musí být sestříhány až po transkripci.
Prekurzorická RNA se v těchto případech
uvolňuje z místa transkripce a je sestřižena na jiném
místě interchromatinového prostoru.
Sledujeme-li obraz FISH (viz rámeček o metodice
na s. 564) specifické RNA, včetně specifického označení
intron-exonových a exon-exonových spojení,
pozorujeme signál buď ve formě terčíku, v podstatě
velmi podobný signálu genu, nebo ve formě protaženého
signálu neboli jaderné cestičky (obr. 22). Sledujeme-li
distribuci transkripčních a sestřihových
faktorů, je možné fluorescenční signál v interchromatinovém
prostoru rozdělit do dvou kategorií. První
není výrazný a odpovídá spíše difuznímu signálu
s místy fokální akumulace. Druhý odpovídá v savčích
buňkách nahromadění faktorů v asi 10 až 50 fluorescenčně
intenzivních jaderných skvrnách (obr. 5).
Řada těchto faktorů, ale ne všechny (obr. 5), jsou
obsaženy rovněž v několika Cajalových tělískách
12. Dynamika jádra dokumentovaná metodou FRAP
(Fluorescence recovery after photobleaching).
V tomto případě byla v buňce exprimující hybridní
protein fibrilarin-GFP osvětlena část jadérka silným
laserovým zdrojem světla (a; šipka), takže v osvícené
oblasti se okamžitě vysvítí (vybělí) přítomné
fluorochromy (b). Po velmi krátké době (řádově
vteřinách, maximálně desítkách vteřin) však začne
vybělená část jadérka opět fluoreskovat (c). Jiné
hybridní proteiny GFP (včetně nově syntetizovaných
bílkovin) putují do vybělené části jádérka a nahrazují
proteiny původní. V podobném uspořádání lze
provádět důležitou metodu FLIP (Fluorescence Loss
In Photobleaching). (Za laskavé poskytnutí obrázku
děkuji dr. J. Malínskému a dr. D. Staňkovi.)
Měřítko 10 m.
13. Obraz Cajalova tělíska
(tmavě) a asociovaného
světlejšího GEM označeného
šipkou. V tomto případě
nebyla použita fluorescence,
ale imunocytochemický
přístup s protilátkou vůči
p80-coilinu a sekundární
protilátkou nesoucí značku
pro stříbřicí metodu. Po
aplikaci stříbřicí metody byl
snímek zhotoven ve fázovém
kontrastu. (Za laskavé
poskytnutí obrázku děkuji
dr. I. Melčákovi.)
Měřítko 10 m.
GRANTOVÁAGENTURAČRPŘEDSTAVUJE
568 VESMÍR 79, říjen 2000 l http://www.cts.cuni.cz/vesmir
(v lidské buňce zpravidla v jednom až pěti). Ta mají
průměr menší než mikrometr a bývají někdy asociována
s jadernými skvrnami a jadérky.
Jak lze tyto obrazy interpretovat? Signál mRNA ve
formě terčíku přísluší zpravidla genu s relativně malou
transkripční aktivitou, přičemž množství uvolněné
RNA z místa transkripce, ať již sestřižené či ne,
je pod detekční schopností FISH. Je možné na něj
také nahlížet jako na právě aktivovaný gen (obr. 22b).
V případě jaderných cestiček zjevně jde o gen s vyšší
aktivitou, přičemž RNA nebyla vůbec sestřižena, nebo
byla sestřižena jen zčásti, neboť cestičky obsahují
jak exony, tak introny.
Jaderné skvrny
Primární roli jaderných skvrn v transkripci lze vyloučit,
neboť transkripční signál je v nich příliš nízký.
Jaderné skvrny slouží jako zásobárny faktorů,
které jsou rekrutovány aktivními geny nacházejícími
se v blízkosti skvrn. Nicméně cestičky vytvořené
nesestřiženou mRNA vedou od genu k těmto skvrnám
(obr. 22e), které tak v sestřihu mohou hrát aktivní
roli. Jak ale potom vysvětlit nízký transkripční
signál ve skvrnách? Imunocytochemií a metodou
FISH (viz rámeček na s. 564) detegujeme nejpomalejší
kroky v rámci nějakého procesu. A jedním
z takových procesů je právě transkripce. Na rozdíl
od základního sestřihu může být regulovaný (či alternativní)
sestřih zpomalený, a navíc může být prostorově
oddělen od sestřihu probíhajícího během
transkripce. Pozorovatelný transkripční signál ve
skvrnách proto nemůže být výrazný. Jaderné skvrny
se jeví nejen jako zásobárny transkripčních a sestřihových
faktorů a jako možná místa regenerace
či tvorby transkripčních a sestřihových komplexů,
ale také jako místa aktivního sestřihu části prekurzorických
mRNA.
Cajalova tělíska
O Cajalových tělískách se soudí, že jsou místem tvorby
transkripčních i sestřihových komplexů. Hrají
snad také roli v jejich recyklaci a nitrojaderném
transportu. Uplatňují se v místech transkripce specifických
genů, např. genů pro některé snRNA a rovněž
aktivních histonových genů. Obsahují řadu jadérkových
složek (obr. 4) a plní zjevně i jistou úlohu
spolu s jadérkem, s nímž se často spájejí.
Jádro jako dynamická organela
Z uvedeného zatím nevyplývá dynamický charakter
jádra. Spíše se může zdát, že v jádře existují stabilní
oblasti, i když v rámci nějakého rovnovážného
rozmístění makromolekul. Opak je pravdou. Dynamika
jádra je úžasná. Pohyb na úrovni kompartmentů
či subkompartmentů potvrzují četné experimenty
(obr. 18). Rychlost pohybu chromatinu, měřená
např. pohybem centromery, je mezi jedním a deseti
mikrometry za hodinu. Také inhibitory syntézy RNA
vyvolají rozsáhlé změny struktury jádra ve velmi krátké
době (obr. 23). Změna polohy genu v jádře je ve
specifických případech mikroskopicky registrována
již 5 minut po jeho aktivaci.
Velmi rychlá je v jádře i záměna identických makromolekul
(obr. 12). Např. histony, které jsou
součástí nukleozomu, jsou v chromatinu stabilně
zabudovány, ale histon tvořící spojení mezi dvěma
nukleozomy setrvává na místě řádově jen několik
vteřin, než je nahrazen stejným typem histonu. Jak
je to s pohybem makromolekul v interchromatinovém
prostoru? Současné poznatky hovoří spíše
o difuzi (obr. 24), ale především v souvislosti se zabudováváním
makromolekul na určitá místa (tj. do
určitého kompartmentu), či naopak s jejich uvolňováním
jde zjevně o pochody vyžadující energii.
Buněčné jádro a nemoc
Změny ve struktuře buněčného jádra jsou asociovány
s bezpočtem onemocnění, která často souvisejí
se změnou chromatinu. Uvedu jen dva příklady
související s jadernými kompartmenty v interchromatinovém
prostoru, Cajalovými tělísky a tělísky
PML.
14. Fluorescenční obraz replikace (zeleně) a transkripce (červeně)
v kultivované lidské buňce v časné fázi S. Obraz se skládá z velkého
počtu zelených a červených domén a výjimečně je vidět překryv ve
formě domén žlutých. Snímek svědčí o tom, že na replikované sekvenci
DNA dochází k útlumu transkripční aktivity. Povšimněte si, že
transkripční signál v jadérku (tmavé skvrny bez fluorescenčního signálu)
není detegován. Je to způsobeno fixací buněk a nedostupností
BrU pro protilátku. Při použití jiné fixace lze v jadérku zaznamenat
vysoký transkripční signál (viz obr. 19 a 20). (S laskavým svolením
Springer-Verlag přetištěno z Chromozoma 108, 325­335, 1999.)
15. Posun replikačního signálu v čase. Většina replikačních domén
vykazuje buď zelenou, nebo červenou barvu, žlutá barva není tak častá.
To znamená, že replikační domény odpovídající dvěma časově odděleným
pulzům již zpravidla nekolokalizují. (S laskavým svolením
Springer-Verlag přetištěno z Chromozoma 108, 325­335, 1999.)
16. Detekce replikační aktivity (podobně jako na obr. 14 a 15)
v natažených vláknech DNA po rozbití buňky i jádra. Obrázek dokumentuje
směr replikace (od zelené k červené) a rychlost replikace
(délkou značených úseků DNA). Rychlost replikační vidličky je
v rozmezí 0,21 až 0,55 m za minutu. (Za laskavé poskytnutí obrázku
děkuji dr. J. Malínskému.)
17. Polytenní chromozom octomilky (Drosophila melanogaster) je přítomen
v obřích buňkách slinných žláz. Vzniká mnohonásobnou duplikací
DNA, výsledkem je několik set dvojšroubovic DNA uložených
paralelně jedna vedle druhé. Na snímku vyznačuje hraniční domény
(zeleně) protilátka proti proteinu BEAF, který se váže na sekvence
scs'. Současně byl mapován sestřihový faktor SC35 (červeně). (Za
laskavé poskytnutí obrázku děkuji Mgr. M. Eltsovovi.) Měřítko 5 m.
18. Uměle vytvořené obří subchromozomální domény v buněčné linii
křečka, čítající 90 milionů párů nukleotidů (90 Mbp) v dvojšroubovici
DNA, v její kondenzované (a) a euchromatinizované formě (b).
Doména se skládá ze stovek duplikovaných identických genů dihydrofolátreduktázy
s vmezeřenými úseky obsahujícími opakující se
vazebné sekvence pro represor laktózy. Represor vykazuje vůči této
sekvenci vysokou vazebnou sílu. Té je využito na snímku a, kdy buňky
byly transfektovány konstruktem, který exprimuje hybridní protein
složený z represoru laktózy a GFP (green fluorescent protein; nicméně
je zde fluorescence uměle dokumentována červeně). Vazbou
hybridního proteinu na vazebnou sekvenci můžeme tuto doménu
pozorovat. Přístupy využívající hybridní proteiny s GFP patří
v posledních letech mezi rozšířené přístupy molekulární buněčné biologie,
neboť hybridní protein fluoreskuje a lze pozorovat i živé buňky.
Obraz (a) představuje detekci obří subchromozomální heterochromatinové
domény o průměru asi jeden mikrometr a nacházející se
poblíž jaderného obalu. V obraze (b) byl pro transfekci použit podobný
GFP-konstrukt, který navíc obsahoval kódující sekvenci pro aktivační
doménu velmi silného aktivátoru transkripce, faktoru VP16.
Tím byla euchromatinizována chromozomální doména, která vykazuje
délku 25 až 40 m s tloušťkou chromonemového vlákna okolo
100 nm. Po euchromatinizaci odpovídá velikost domény několika
chromozomálním teritoriím (je zajímavé srovnání její velikosti
s obrazem domény v (a)!). K euchromatinizaci došlo i nezávisle na
aktivní transkripci, tj. i v případě podání inhibitoru syntézy RNA. Aktivační
doména v hybridním proteinu vázaném na DNA sama o sobě
vyvolá masivní zapojení faktorů účastnících se přestavby chromatinu,
včetně transkripčního aparátu, a lokální změny ve vyšším hierarchickém
uspořádání chromatinu se rozšíří na celou 90 Mbp subchromozomální
doménu. Cytochemicky byla v (a) i (b) dobarvena (zelenomodře)
DNA. (Přetištěno z J. Cell Biol. 145, 1341­1354, 1999; za
laskavé poskytnutí obrázků děkuji Dr. A. Belmontovi a za laskavý
souhlas s jejich použitím The Rockefeller University Press). Měřítko
5 m.
23. Inhibitor syntézy RNA (v tomto případě a-amanitin) vyvolá velmi
rychle změnu uspořádání jádra (b) ve srovnání s normálním stavem
(a). Dokumentována je změna jaderných skvrn (mapován byl faktor
SC35), které se zvětší a zakulatí. Zároveň se sníží celkový nukleoplazmatický
signál. (S laskavým svolením Springer-Verlag přetištěno
z Chromozoma 108, 325­335, 1999.)
24. Pohyb mRNA skládající se ze dvou exonů a jednoho intronu. Po
mikroinjekci je RNA signál v jádře víceméně homogenní. Po několika
minutách se mikroinjikovaná RNA akumuluje v jaderných skvrnách,
jak je v obrázku dokumentováno žlutou barvou (c). Pohyb
v interchromatinovém prostoru zjevně odpovídá difuzi. RNA byla
detegována červeně (a) a jaderné skvrny zeleně (b). Kombinace obou
signálů je patrná jako žlutá barva na snímku c. (Za laskavé poskytnutí
obrázku děkuji dr. I. Melčákovi.)
GRANTOVÁAGENTURAČRPŘEDSTAVUJE
s
s
s
s
http://www.cts.cuni.cz/vesmir l VESMÍR 79, říjen 2000 569
19. Detekce replikace (zeleně), rRNA (červeně) a transkripčních míst
(modře) v jadérku v časné fázi S buněčného cyklu. Replikační signál není
v jadérku detegovatelný, neboť rDNA je replikována v pozdější etapě
fáze S. Transkripční místa částečně odpovídají místům distribuce rRNA
(fialově). (Za laskavé poskytnutí obrázku děkuji Mgr. A. Plissovi.)
20. Pohyb rRNA v jadérku. Krátkým pulsem BrUTP byla značena transkripce
(červeně) a 20 minut nato deteovány transkripty a GFP-fibrilarin (zeleně).
Pokud je detekce provedena bezprostředně po značení transkripce,
oba signály se překrývají. Z pozorování vyplývá pohyb rRNA (viz zvětšený
detail jadérka) vůči doménám obsahujícím GFP-fibrilarin, v nichž dochází
k syntéze rRNA. (Za laskavé poskytnutí obrázku děkuji dr. D. Staňkovi.)
21. a ­ Lokalizace lokusu CD4 (zeleně) v buněčné linii T-lymfocytů, v nichž
je gen CD24 aktivní. Červeně je značena c-satelitní DNA. b ­ Lokalizace
téhož lokusu v buněčné linii B-lymfocytů, v nichž je neaktivní a je asociován
s heterochromatinovou g-satelitní DNA (žlutě) prostřednictvím faktoru
Ikaros. (Přetištěno ze Science 280, 547­553, 1998; děkuji za laskavé
poskytnutí obrázků Dr. A. Fischerové a dr. K. Brownové a za laskavý souhlas
s jejich otištěním The American Association for the Advancement of
Science.) c ­ Schéma souvislosti aktivace i represe genu CD4 s pohybem
genu vůči heterochromatinu. Měřítko v obr. 21a­21b odpovídá 2 m.
22. Příklad mapování specifického genu i jeho transkriptů a putování
transkriptů k jaderným skvrnám v lidských buňkách. Gen je v buněčné
linii přítomen ve dvou kopiích pouze na jednom ze dvou chromozomů 1.
Geny jsou aktivně transkribovány a alternativním sestřihem se tvoří
několik mRNA kódujících různé proteiny.
a ­ Mapováním genu je získán obraz dvou blízkých fluorescenčních bodů.
Je-li buňka v G2 fázi, můžeme pozorovat dvě dvojice fluorescenčních
bodů. Měřítko 5 m.
b, c ­ Dva příklady mapování genu (červeně) a mRNA (zeleně).
b ­ Zde je signál RNA ve formě terčíku velice podobný obrazu genů a může
např. odpovídat aktivaci genu po proběhlé mitóze. Měřítko 5 m.
c ­ Velká většina RNA signálů (zeleně) má tvar ,,cestičky". Všimněte si,
že jeden z genů (červeně) je v cestičce polárně orientován, druhý gen
1715 1614
19
18a 18b
20 21a
Obr. 22
23a 23b 24a 24b 24c
a b d ec
se nachází uvnitř cestičky. Oba geny jsou transkripčně aktivní. Měřítko
2 m.
d ­ Mapování RNA-signálu (červeně) vůči jaderným skvrnám (zeleně;
použita byla protilátka SC35) svědčí o podobné lokalizaci konce
cestičky se skvrnou. Povšimněte si fokálního signálu faktoru SC35
na opačném konci cestičky (je zvýrazněn při použití ,,vrstevnicového"
filtru v konfokálním mikroskopu a ukazuje na něj bílá šipka). Tento
lokální signál svědčí o sestřihu RNA ještě během transkripce. Měřítko
2 m.
e ­ Současné mapování genů (červeně; malé šipky), transkriptů (zeleně)
a jaderných skvrn (fialově; delší šipka). Transkripty putují od
genů ke skvrnám. (Přetištěno z Mol. Biol. Cell. 11, 497­510, 2000
s laskavým souhlasem The American Society for Cell Biology.)
Ikaros
heterochromatin
aktivní gen
v euchromatinu
inaktivní
gen
21b
21c
buňka T buňka B
572 VESMÍR 79, říjen 2000 l http://www.cts.cuni.cz/vesmir
Existuje korelace mezi spinální svalovou dystrofií
(SSD) a strukturou Cajalových tělísek. V některých
buněčných typech jsou Cajalova tělíska asociována
s dalším typem tělísek, zvaných GEM (Gemini of Cajal
bodies; obr. 13). U pacientů je v Cajalových tělískách
přítomen protein SMN1, který je příčinou
svalové dystrofie. Jeho mutace způsobují chybu
v biogenezi snRNP a sestřih prekurzorických mRNA
se stane nefunkčním. Je-li s Cajalovým tělískem asociováno
tělísko GEM, je SMN1 protein u dystriofie
specifickou značkou tohoto tělíska. Stojí jistě za pozornost,
že značné procento dědičných onemocnění
má podstatu právě v chybném sestřihu.
Tělíska PML jsou ve srovnání s Cajalovými tělísky
menší a často jich na jádro lidské buňky připadá více
než deset (obr. 6). Někdy se vyskytují ve spojení
s Cajalovými tělísky. Jednou z jejich specifických
bílkovin je protein PML. U promyelocytární leukemie
se v souvislosti s translokací chromozomů tato tělíska
rozpadají. Během translokace se v sekvenci
DNA spojí gen kódující protein PML a gen pro receptor
kyseliny retinové (RAR) ­ vznikne hybridní
protein PML-RAR. Stačí buňkám podat kyselinu retinovou
a tělíska PML se opět vytvoří.
Buněčné jádro v novém miléniu
Ještě před 10 lety bylo studium buněčného jádra téměř
výlučně popisné. Dnes se přeneslo na molekulární
úroveň a existují předpoklady pro to, že se naše
vědomosti o struktuře chromatinu vyšších řádů
a funkci jaderných kompartmentů v blízké budoucnosti
významně prohloubí. Molekulární buněčná biologie
už přinesla detailní poznatky o replikaci DNA,
syntéze a vyzrávání RNA, a také o transportu makromolekul
mezi jádrem a cytoplazmou (skrze neustále
vytížené jaderné póry se v jedné buňce přepraví sem
a tam milion makromolekul za minutu). Výsledky prací
z posledních let svědčí i o pokroku v poznání strukturně-funkční
organizace opravných mechanizmů
DNA a jaderné degradace RNA i proteinů. Snad také
po mnoha letech úsilí zodpovíme otázku, zda existuje
či neexistuje jaderná ,,matrix" nebo nějaká forma
jaderného skeletu, jak jej známe v cytoplazmě.
Jádro je vysoce dynamická organela, pro niž jsou
typické její kompartmenty, ať již ve smyslu jednotlivých
chromozomálních teritorií či kompartmentů interchromatinového
prostoru. Rozdělení na kompartmenty
je pro metabolizmus jádra ,,ekonomicky" výhodné
a umožňuje předběžnou tvorbu makromolekulárních
komplexů, které pak provádějí složité procesy
replikace, transkripce i vyzrávání RNA. Jádro nelze
považovat za ,,chromozomy a jadérka plovoucí
v jaderné šťávě". Je to naopak organizovaná organela
s přísně regulovanou vysokou funkční přizpůsobivostí
struktury. Hlubší porozumění funkci buněčného
jádra a znalost kompletní sekvence lidského genomu
otvírají úplně nové perspektivy pro genovou terapii
a přispějí k revoluci v lidské medicíně. o
GRANTOVÁAGENTURAČRPŘEDSTAVUJE