Základy proteomiky 2007 Proč právě proteomika? Jan Hejátko AtMo/e Proteomika 2007 MASARYK UNIVERSU Základy proteomiky 2007 Schéma přednášek ze Základů proteomikv 2007 Lblok. 25.4. 2008 Proč právě proteomika? (Jan Hejátko) Exprese a purifikace rekombinantních proteinů (Radka Fohlerova) 2. blok. ?. ?. 2008 Funkce proteonů (Lubomír Janda) Určování třírozměrných proteinových struktur metodami proteinové krystalografie (Jaromír Marek) 3. blok. ?. 5. 2008 Metody separace proteinů (Hana Konečná) Analýza obrazu 2-D gelů (Ivana Urbánková) Identifikace proteinů hmotnostní spektrometrií (Zbyněk Zdráhal) ntMo/e MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007 Základy proteomiky 2007 Proč právě proteomika? Postgenomova éra a co s informacemi, které neumíme číst Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování Od genu k proteinu a zpět Přístupy současné proteomiky exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů diferenční proteomika analýza posttranslačních modifikací ntMo/e MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007 Základy proteomiky 2007 Proč orávě oroteomika? PROTEOME = PROTEins expressed by genOME (konference 2-D ELFO, Siena, 1994) DNA: GENOME, HAPLOME, EPIGENOME RNA: TRANSCRIPTOME ORFEOME, PROTEOME, LOCALISOME, INTERACTOME, METABOLOME, PHENOME, ... PHENOME: kombinace různých dat, zahrnujících fenotyp, expresní data různých (ideálně všech) genů daného organismu a proteinová data (interakce, jednotlivé vlastnosti proteinů, ...) Proč vůbec studovat proteiny, když máme tolik genetických dat? (sekvence genomů, expresní profily genů, fenotypy mutantů,...?) & V koncovém výsledku, tedy fenotypu, se vždy projeví regulace na všech úrovních, od genu po protein a jeho modifikaci ntMo/e ;onci e vz< OGICKY PROBLEM V i_ n r k / MASARYK UNIVERSIT Proteomika 2007 Anotace genů a odhad aminokyselinových sekvencí předpokládaných proteinů Postaenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst dnes k dispozici v databázích více než 700 000 záznamů (nr databáze) různých organizmů Získané informace lze zpracovat pomocí bioinformatiky s" Mammals Birds Insects Flatworms Amphibians Reptiles 19470700 19470500 19470300 19470100 19469900 19469700 19469500 19469300 19469100 19468900 19468700 19468500 19468300 19468100 19467900 19467700 cacacctatatgtatagctcaattctagataaaatatatagaaatggatcttgagaatcattttttttgtattcttttgttat gctccgaggaagaagataatatgaaaagagctttttagggtttatcattctccttgactttgcaaaacgtgaaatgtaaggcč tgttgctttttatacgtatcgcttcctacaataagttaacaatgcttcctcgtagaattgcaaaacatttgtggaccgtgatt Proteomika 2007 i ttcagtggcttctttgcagcagcttcttccttggaggactaatcaagacagaaatctgttcctctaaaaacgatcgccgttct ttgacgagtcttgatctttagaatcaaatttataagggatcacgagatacacgtattaattattattttttttttttttgctt tcactcaaatgatggtgaaagttacaaagcttgtggcttcacgtccaattgtggtcttttgcgtcctggtaattctgctttct atgattctacatttctactcatctcgttcttgtttttcaaatgatataattattgtgtgtatatcacccattcatgtatattt ttcctggtggttgttttcgagtgcatttggatctcaaattggcgaacaacaacggagaacctagtcaaagaggtcgcttcatt caagtctagtttcggagattgaaaacatcggaaaatttacatatgccaagacaaacttatctacgatcggtttagcgagagtt caacaacgacactggttttacagagattcaaacacaggttgttaaaactaattacataaattcaattattcttagttattatc tatataacattaactataattttatgttgttgttgttgttgttattattgttcttcagatcgcaccattgttgtttgtagctt gtctcacaagtttcgtacatcagtagggacggtctcatgttttcttacattgcagaatcaaacacaagtgtcgctgtttttgc caagtcgtggagactacacttggtacactcaaaccgtggatcagttaactggtcgtcttaacgggaactcaacgaaatctcac tacagattggttccaagcagcacagagtaataactacactacagcctttgtaggaacgagcttgggaggagaagataacgagč gttagcttgtacagcaagaaaggtcttgtttctttagggtttccggttaagactttaaccgaagttttgaacagtttgaatct acatgtggacaaaggacgggacggtgcttgttcgtgaaggttcactgaatgattctttcttcatctccaatggctcgatttgc ctccctctggtctcaatgcatccctgaaaattgcagttccagtggctacgaggtggagatcaaaagattaagataccaagctt gtttcgggcgttcctctggtaaatactgaaacatatttcactttgatgcagtaaaaatgcatcgacttgttgtttctcagctt tttgccagagatacacactcatgtttcccaacaaaggaggagcaacacgcatcaagcaccaagcggaaaaggcaaaatatcac atttcttggcttcggttggcctgtatggtttgtgtggtttatgatgcaagcaacaaggagagagatgcatatgcgtgcaacgc gcgacacaacaagctgagagaaagagcatgaacaagagtcaagcatttgcaaatgctagccacgatattagaggtgcccttgt ttgatatatgtcgtgatggagttaaacctggctccgacgtagacaccactctcaaccaagtgaatgtttgcgccaaggatttc tctttagctttctcttatgcgttttcttcactttctctctaacagaaaattcttcctcatgttgttaaaattacagctctgct tgagcaaaatcgaaagcgggaagatgcagttagtggaagaagatttcaacttgtcgaaacttcttgaagacgtcatcgatttt gaagaaaggggttgatgtagttttggatccgcacgatggctcggttttcaaattctcgaatgtacgaggggatagtggcagac aatcttgttagcaatgctgtcaagttcaccgtcgacgggcacattgcggtaagagcttgggctcagaggccaggttccaatac catatcctaaaggtgtgtccaagtttgtaaagagtatgttctgcaagaataaagaagagtcatcaacctacgagacagaaatc caatgcaaacacgatggagtttgtgtttgaagtggatgatactggtaaagggatacctatggagatgcgtaagtcggtatttc agagaaacagctcaaggacaccaaggaactggtttagggctcgggattgtgcagtctttggtaagctactaaaacagaacacc taaatctagatggttttcatttgtggtctattattataggtaagattaatgggaggggagataagaatcaccgacaaggccat gtttccaattcaatgttttattgacaacattagagtctcctccagtgagtgacatgaaagtgagacaggagatcgaagcaggŕ gccaaacctcgggctgactataaacacttcacttggaggtagcatgaatatacgtaacctgagtcctagattcaacaactgtc Predikce funkce genů in silico struktura genů struktura genů promotor počátek transkripce 5'UTR počátek translace místa sestřihu TATA ATG....ATTCAT» 5UTR stop kodon 3'UTR polyadenylační signál ATTATCTGATATA ....ATAAATAAATGCGA 3'UTR MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007 Anotace genů a odhad aminokyselinových sekvencí předpokládaných proteinů Postaenomová éra a co s informacemi, které neumíme číst dnes k dispozici v databázích více než 700 000 záznamů (nr databáze) různých organizmů Získané informace lze zpracovat pomocí bioinformatiky TCAAAGGGTTTCGACTTTGCTCCGAGGAAGAAGATAATATGAAAAGAGCTTTTTAGCiCiTTTATCATTCTCCTTGACTTTGCAAAACCiTGAAATGTAAGCiCACTTTGATCGTTGTACTTTGTTCiCTTTTTATACCiTATCGCTTCCTACAA ■ I.........I.........I.........I.........I.........I.........I.........I.........I.........I.........I.........I.........I.........I.........I....... 3427 | AGTTTCCCAAAGCTGAAACGACiCiCTCCTTCTTCTATTATACTTTTCTCGAAAAATCCCAAATAGTAAGAGGAACTtiAAACtiTTTTGCACTTTACATTCCGTGAAACTAGCAACATtiAAACAACGAAAAATATGCATAGCGAAGGATGTT RAF -uORF------- -029311b low- Hpal Leo CRI Sad P v u I TAAGTTAACAATGCTTCCTCGTAGAATTGCAAAACATTTGTGGACCGTGATTTACATGACTGAGCTCTTTTCAGTtiGCTTCTTTGCAGCAGCTTCTTCCTTGGAGGACTAATCAAtiACAGAAATCTGTTCCTCTAAAAACGATCGCCGT ATTCAATTGTTACGAAGGAGCATCTTAACGTTTTGTAAACACCTGGCACTAAATGTACTGACTCGAGAAAAGTCACCGAAGAAACGTCGTCGAAGAAGGAACCTCCTGATTAGTTCTGTCTTTAGACAAGGAGATTTTTGCTAGCGGCA - exon 3 - Psil Bss issSl Asel Hindlll TCTAGGTAATCTTGCCATTCTTGACGAGTCTTGATCTTTAGAATCAAATTTATAAGGGATCACGAGATACACGTATTAATTATTATTTTTTTTTTTTTTGCTTTTTGTGGTTATACAAGTTCACTCAAATGATGGTGAAAGTTACAAAG • I ■ ■ I ■ • I ■ ■ I ■ ■ I ■ • I ■ ■ I ■ • I ■ 3725 AGATCCATTAGAACGCiTAAGAACTGCTCAGAACTAGAAATCTTAGTTTAAATATTCCCTAGTGCTCTATGTGCATAATTAATAATAAiiAAAAiAAAAACGAAAAACACCAATATtiTTCAACiTGAGTTTACTACCACTTTCAATGTTTC , H M V K V T K imgBI Mfel CTTGTGGCTTCACGTCCAATTGTGGTCTTTTGCGTCCTGGTAATTCTGCTTTCTTTCTTCTAAATTATACGATGATTCTACATTTCTACTCATCTCGTTCTTGTTTTTCAAATGATATAATTATTGTGTGTATATCACCCATTCATGTA ----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------1----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------1-----------1----------,----------1-----------1-----------1-----------1-----------1 i ■ i , GAACACCGAAGTGCACiCiTTAACACCAGAAAACGCAGGACCATTAAtiACGAAAGAAACiAAGATTTAATATGCTACTAAGATtiTAAAGATGAGTAGAGCAAGAACAAAAAGTTTACTATATTAATAACACACATATAGTGGGTAAGTACAT ■XckJ Proteomika 2007 A S R P [ V V F C V L Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování Genom vs. Proteom HkÜ1 ť m tes3iüffl!l f^^^^^^^k Danaus plexippus (monarch) Gen Transkript f\ Protein "V Fenotyp AtMo/e MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007 Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování Možná analoaie s textem a ieho interpretací DNA: Kdyžadoperbtabijsenr dfjfwůc aknclůsmnjxldalnxckjcnbychcxma zdciksrdceasnanazxcnlsdlaň. Když----------------jsem---------snídal—r4-----dal----------byeh----------------grottos-.------na--------dlaň. RNA: Když jsem s ní, dal bych si srdce na dlaň. Když jsem s ní, dalaojp^BSBrfdeeiaadfcoäň. Když jsem snídal srdce. PROTEIN: riVtMo/e, MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007 Od genu k proteinu a zpět Základní mechanismv reaulace aenové exorese regulace transkripce sestřih RNA Proteomika 2007 Základní mechanismy re strukture ■ struktura genů promotor počátek transkripce 5'UTR ^^^^^^^ počátek translace / ___ místa sestřihu / j^ stop kodon / / 3'UTR / V polyadenylační signál / ^^^^^ (v/ ( ^^^ \/ ^^^^^-^ ^ B^^^^W A ^**-~—\—^M Prote íomika 2007 (h gulace genové exprese a genů TATA ATG....ATTCAT 5UTR ATTATCTGATATA ....ATAAATAAATGCGA 3'UTR MASARYK UNIVERSIT' Základní mechanismy regulace genové exprese regulace transkripce odchylky rozpoznávání míst sestřihu u rostlin v praxi vývojové plasticity (nejen) rostlin identifikace mutanta s bodovou mutací (tranzice G—>A) přesně v místě sestřihu na 5' konci 4. exonu AI\A"\!l Asel Psil Fen! Bpml I OXIXSATTiO^AAGITGri^^ m i I m i | m i I m i | m i I m i | m i I m i | m i I m i | m i I m i | m i I m i | m i I m i | m i I m i | m i I m i | m i I m i | m i I m i | m i I m i | m i I m i | m i I m i | m PflMI I S^CGOTiAIGITrcJ&CA^^ GTCTZOTC&ÍTrCIATrinriÄT^ CTGCGAATTACAAAť GACGCTTAATGTTT miTcrrc 11111111 L F F — m ATAAGAAGAACGAC. L F F L L PDR Ula/PDR LI wt pisl štence podobný« itantní m RNA se íukaryot, viz dopi 500 bp a00 bp 300 bp 200 bp 100 bp PDR_U1b/PDR_Llb wt pisl Imechanizmu pro asného stopkodc jíSe^atcrra, Singh 500 bp '-G0 bp 300 bp 200 bp 100 bp I I K P G ÍCCAGGAAGGTTAGTAGTTG- . Spliceosonne >50-55nt Active NMD complex 3GT CCTTC CAATC ATCAACAGAGGAT TGATC AAAAC TAGTT TC AAAAT ATGGAAGT TC ACACGA V i. I K V L -no splicing — __ Pstl I Pvull [VT TT TTT TG CTGCAGCTGT GTGAAGTT TG TAC CT TTT C JAAAAAAACGACGT CGACACAC TT CAAAC ATGGAAAAG +++ +++ +++ +++ N N L K Základní mechanismy regulace genové exprese přeskupování subgenů při produkci protilátek Přeskuoování subaenů iako soecifickv mechanismus oři orodukci orotilátek protilátky variabilní oblast (V) a konstantní oblast (C) a lehký (L) a těžký (H) řetězec každá z V oblastí L řetězce u myší je kódována 2 subgeny (V a J) každá z V oblastí H řetězce u myší je kódována 3 subgeny (V, J a D) \ l-Jfthi \ 4fy chain Proteomika 2007 v zárodečných liniích myších B-lymfocytů dochází k tzv. kombinatorické diversifikaci (přeskupování) subgenů (místně-specifickou rekombinací) L řetězec (k): cca 300 V sub-genů a 4 J subgeny (300 x 4 = 1200 možností) H řetězec: cca 500 V sub-genů, 4 J subgeny a 12 D subgenů (500 x 4 x 12 = 24000 možností) celkové množství kombinací u myší: cca 1200 x 24000 = 28 mil. různých V oblastí (protilátek rozpoznávající různé antigény) antigen indukuje tzv. mechanismem somatické hypermutace po aktivaci B-lymf. pomocnými T-lymf. dochází ke zvýšenému výskytu mutací ve V oblastech (1 mutace/V oblast/generaci, cca 1 mil. X vyšší než je obvyklé (např. u tzv. „house-keeping" genů) a selekci protilátek se zvýšenou afinitou k antigénu regions of DNA to be joined germ-line DNA DNA REARRANGEMENT DURING B CELL DIFFERENTIATION V3\\ C J3J4 TRANSCRIPTION RNA transcript RNA SPLICING TRANSLATION NK? light chain I W~""~ V3 J3 C Od genu k proteinu a zpět Základní mechanismv reaulace aenové exorese regulace transkripce sestřih RNA translační represe ntMo/e V i_ n r k / MASARYK UNIVERSIT Proteomika 2007 Regulace genové exprese mechanismem translační represe • Funkční význam sestřihu v nepřekládaných oblastech - důležitá regulační součást genů GAGGAGGCACAAMTGACGAA -//- TGTATTeTTTTGTTATCAAAajGTTTCGACTTTGCTCCGAGGMC^AGATAATATcaG^^^ ® R I P R G Q . L M L (ill P Us E ■* P A I ATGaaaagagctttťN GAGGAGGCACAAMTGACGAA -//- GTTATACAAGTTCACTC^AATGATGGTGAAAGTTACAAAGCTTGTGGCTTCACGTCGGATCCCu ~"^" .oGTCAGTCCCTTATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACC M M V K V T KLVASR Rl PRVGQSLMLRPVETPT M -KintroR A F V prípade CKM pokus prokázat tento způsob regulace genové exprese pomocí transgenních linií nesoucích u id A pod kontrolou dvou verzí promotoru, zatím nepotvrzeno ATGatggtgaaagttaca. M M V K V T... ATGatggtgaaagttaca. «I* Mo/«. atggtgaaagttaca. M ASARY K UNIVERSIT' Proteomika 2007 Expression of CKI1 in Diploid Generative Tissue Inflorescence V i_ n r k f MASARYK UNIVERSIT Proteomika 2007 Od genu k proteinu a zpět Základní mechanismy reaulace aenové exorese regulace transkripce Sestřih RNA translační represe posttranskripční umlčování mechanizmem siRNA ntMo/e MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007 Od genu k proteinu a zpět umlčování genů mechanismem RNA interference (RNAi) Multigene family oř Foreign DNA (naked) repetitive Iransgene Foreign dsRNA Developmental or experimental transcription w» nmmmi nosními mnnnnmr mmO juht'iO Transgene CH3 + - - - f • ^^ V___J \J' X------- assembfW • shRNA pne-miRNA Transgene assembfy/ DMA/chromaiin Tiodification T CH3 annnffiffir )e^A 11111 r 11 r i r 1111 intermediate Silencer llllllllllllll dsRNA (Wcer) llllll li jim sifiNA llllll ...... MINI Mint LLLLLL {..... Target mmm Haterochfomatin formation and transcriptional silencing linn " 11J111 stRNA li I III' \JJ-L miRNA TTTTTT -TTTTTr -LLLLU- mni LLLLLL \ -—-Ä tt I Rise/ VRísC/; «'sc JQL. —AAAA m R NA destruction or translations! repression ntMo/e Mello, 2004 MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA" H H_____ BF ] i j __j Andrew Z. Fire Craig C. Mello USA Stanford University School of Medicine Stanford, CA, USA b. 1959 USA University of Massachusetts Medical School Worcester, MA, USA b. 1960 fl'fe: MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007 Od genu k proteinu a zpět mskripční umlčování mechanizmem siRNA ;větů u ArabidoDsis prostřed n ictvím miRNA lánů u rostlin i orgánů dochází k určování identity jednotlivých květních orgánů omeiotických genů dují většinou rostlinné homolgy MADS-box cými geny dochází k tzv. katastrálním io genu inhibuje expresi dalšího např. AP1 je nejprve aktivní v celém květním meristému, po indukci exprese AG pak AG inhibuje expresi AP1 ve vnitřních dvou kruzích) výjimkou je exprese genu AP2, jehož mF meristému, ale exprese AP2 je re prostředictvím miRNA (gen miRNA 172) s^/Mks, •^ LFY pgrffi -i-UF(V7+WU5 WHORLl WHORÍ1 WHGRL3 WHORLi A AP1 SEPALS PETALS STAMENS CARPELS III mim* ^K ^V MASARYK UNIVERSIT' in situ lokalizace miRNA172 v 3. a 4. kruhu Od genu k proteinu a zpět Základní mechanismy reaulace aenové exorese regulace transkripce Sestřih RNA translační represe posttranskripční umlčování mechanizmem siRNA směřování proteinů ntMo/e MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007 Od genu k proteinu a zpět směřování (cílování) proteinů Intracelulární lokalizace oroteinů v rostlinných buňkách dochází k velice dynamickým procesům, zprostředkovávaným zejména tzv. endomembranovým transportem (viz film, GFP směřované do ER) endomembranovy transport je důležitým regulačním mechanismem při přenosu signálu a regulaci buněčných procesů CV, central vacuole; DV, dense vesicle; ER, endoplasmic reticulum; GA, Golgi apparatus; LV, lytic vacuole; N, nucleus; PAC, precursor-accumulating compartment; PB, protein body; PCR, partially coated reticulum; PSV, protein-storage vacuole; PVC, pre-vacuolar compartment; SV, secretory vesicle. Surpin and Raikhel, 2004. Proteomika 2007 Od genu k proteinu a zpět směřování (cílování) proteinů Cyklování auxinových přenašečů u Arabidopsis auxin je rostlinný hormon se silným morfogenním účinkem proteiny podílející se na transportu proteinů jsou tzv. PIN proteiny, polárně lokalizované v bunňkách kořene u Arabidopsis PIN proteiny cyklují v endomembranovem systému rostlinné buňky v přítomnosti inhibitorů e těchto proteinů v intr ....čímž je zároveň n -----------------------------------------------------1 1 ~^[ .:_ n i •J ! í ■ ■ Proteomika 2007 í\RYK UNIVERSU Od genu k proteinu a zpět Základní mechanismy reaulace aenové exorese regulace transkripce sestřih RNA translační represe posttranskripční umlčování mechanizmem siRNA směřování proteinů posttranslační modifikace proteinů ntMo/e MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007 Od genu k proteinu a zpět postranslační modifikace proteinů Vvznam oosttranslačních modifikací proteinů regulace enzymové aktivity regulace interakcí proteinu s dalšími proteiny nebo jinými biomolekulami lokalizace proteinu v buňce změna mechanických vlastností proteinu přenos signálu ntMo/e MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007 Od genu k proteinu a zpět postranslační modifikace proteinů »osttranslačních modifikací proteinů přidání glykosylfosfatidylinositolové (GPI) kotvy fosforylace sulfonace glykosylace N-myristolyace N-metylace hydroxylace karboxylace prenylace ntMo/e MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007 Od genu k proteinu a zpět postranslační modifikace proteinů Přenos sianálu a reaulace aenové exprese prostřednictvím fosforvlace přenos cytokininového signálu u rostlin input signal {» SMAMEMBRAI du.so * (\l4ib.ialB 11 GFP UV CP1T- [3 ä Qhk2 ahk3 C KM CKI1H405Q CKI1D1050N /ARR2 /ARR2 /ARR2 - + CK CKI1/CKI1H406Q /CKI1D1050N ARR2 MMo/e MASARYK UNIVERSIT Proteomika 2007 CHASE Kinase Receiver GAR P domain domain domain domain Current Opinion in Plant Biology' I Základy proteomiky 2007 Proč právě proteomika? Postgenomova éra a co s informacemi, které neumíme číst Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování Od genu k proteinu a zpět Přístupy současné proteomiky exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů ntMo/e MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007 Přístupy současné proteomiky exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů Technoloaie rekombinatních proteinů umožňuje získat velké množství analyzovaného proteinu ve velké čistotě využívá technologie rekombinantní DNA principem je vložení „přívěsku" prostřednictvím přípravy rekombinantní DNA, který usnadní purifikaci (afinitní purifikace) možnost využití „přívěsku" i pro lokalizaci a další________________ gene 1 0 RBSi rCBP PT//IqcOt // rV.CS Calmodulin 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 Hi Load 16 60 Superdex75 prep grade 23 10 06001:10_UV@01,PEAK 3cgl Beg ľ B sel EO057I ca:cc ŕ ' ■ ■ ' ;:"::;:: ľ G v v v N ■TCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACGGGNAGCTGCCCGTG I.........I.........I.........I.........I.........I.........I.........I.........I..... 705 | I^AGTCGCACAGGCCGCTCCCGCTCCCGCTACGGTGGATGCCGTTCGACTGGGACTTCAAGTAGACGTGGTGCCCNTCGACGGGCAC FSVSGEGEGDATYGKLTLKFt CTTG V S G -GFP--- J Základy proteomiky 2007 Proč právě proteomika? Postgenomova éra a co s informacemi, které neumíme číst Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování Od genu k proteinu a zpět Přístupy současné proteomiky exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů ntMo/e MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007 Přístupy současné proteomiky analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů Analvza vztahu mezi funkcí a strukturou proteinu využívá technologie produkce rekombinantních proteinů a místně řízené mutageneze umožňuje analyzovat strukturu rekombinantního proteinu pomocí rentgenové krystalografie nebo NMR kopmparativní analýzou lze pak analyzovat strukturu a funkci jak u strandardního typu tak i mutantního proteinu W373 F200 3731 F461 J3Kv V i_ n r k / MASARYK UNIVERSIT Proteomika 2007 Základy proteomiky 2007 Proč právě proteomika? Postgenomova éra a co s informacemi, které neumíme číst Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování Od genu k proteinu a zpět Přístupy současné proteomiky exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů diferenční proteomika ntMo/e MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007 Přístupy současné proteomiky komparativní proteomika Analvza změn oroteomu oraanismu na různé stimuh využívá technologií vícerozměrné separace proteinů (nejčastěji ELFO nebo LC) umožňuje analyzovat mnoho proteinů najednou pomocí analýzy obrazu lze odhadnout proteiny se změnou vlastností, příp. kvantity za daných sledovaných podmínek (mutace, vývojové stadium, fyziologická odpověď) 'výšená hladina endogenních CK a b c wild-type AtMo/e Proteomika 2007 pOp-iptíLhGR pOp-iptILhGR line 11 line 13 MASARYK UNIVERSU Přístupy současné proteomiky komparativní proteomika Wtcol. O pOp-ipt11(5)/LhGR pOp-ipt13(2)/LhGR Proteomika 2007 HPCd DEX Přístupy současné proteomiky komparativní proteomika Spot % Vol Relative Abundance Accession No. Protein Name MALDI-MS Score %Cov LC-MSMS Score %Cov MM [kDa] Pi 1105 n r5r 3.55 <0.01 <0.01 3.40 2.50 > 100 <0.01 <0.01 <0.01 > 100 0.37 > 100 2.69 > 100 0.42 L S47970 BAB01146 BAA84393 Q8LBJ7 AAG51430 Q9SUI9 E71425 T05413 Q9LJE4 F86262 AAM20572 AAL36245 H84808 Q941D3 T47470 14-3-3 protein homolog RCI2 AP000373 NID Qasmonate iducible, myrosinase-like) AP000423 NID (RuBisCO large subunit) 50S ribosomal protein L12-C AC008153NID(2-cys peroxiredoxin BAS1, chloroplast [Precursor]) ATP synthase gamma chain, chloroplast Hypothetical protein (putative epoxide hydrolase) cinnamyl-alcohol dehydrogenase (EC 1.1.1.195) F28A23.10 GloEL protein, chaperonin, 60 kDa F13K23.15 protein (glyceraldehyde-3-phosphate dh) AY099721 NID (Cysteine synthase, mitochondrial [Precursor]) AY063889 NID (50S ribosomal protein L4, chloroplast [Precursor]) probable annexin At5g19940/F28l16_90 (Hypothetical protein) isovaleryl-CoA dehydrogenase 97 725 116 26 87 29 131 29 81 23 128 26 63 11 123 130 92 393 40 86 217 388 236 59 90 142 213 20 16 11 32 5 7 10 33 28 4 9 10 18 28.1 48.5 52.9 19.7 29.1 33.3 33.4 38.7 63.3 42.8 45.8 30.5 36.2 26.5 44.7 5.0 5.0 5.9 6.0 6.9 5.1 6.2 5.4 5.6 8.2 8.4 8.9 6.9 9.5 7.5 2203 ľl 2310 A 2402 2801 4503 _□_ t [ r 5204 t\ 7009 f] 7401 n 7606 r ^vatťt Mo/eA, 7701 8202 A r 8302 8605 _É_ t r lue B^H 8803 A c \ ■ L - n - r - k / MASARYK UNIVERSI Proteomika 2007 Základy proteomiky 2007 Proč právě proteomika? Postgenomova éra a co s informacemi, které neumíme číst Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování Od genu k proteinu a zpět Přístupy současné proteomiky exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů n diferenční proteomika analýza posttranslačních modifikací ntMo/e MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007 Přístupy současné proteomiky analýza posttrranslačních modifikací Analvza Dosttranslačních modifikací pomocí specifických metod lze identifikovat kotranslační a posttransalční modifikace, buď v gelu nebo po blotování na membránu (barvení spec. barvičkami) identifikace modifikací pomocí MS technik (MALDI TOF, ESI-MS, ...) fosforylace přenos signálu acetylace regulace chromatinových strruktur a transkripční aktivity prostřednictvím regulace vazby histonů glykosylace velice heterogenní (aktivátor plasminogenu 3 místa pro glykosylaci na N-konci, až 11. 520 SYF^PM/izoforem) Pro-Q Diamond ruznýc nosti rů lo proteinu (K UNIVERSU Proteomika 2007 Základy proteomiky 2007 shrnutí Proč právě proteomika? Postgenomova éra a co s informacemi, které neumíme číst Genotyp vs. fenotyp, aneb co všechno se děje při vyjadřování Od genu k proteinu a zpět Přístupy současné proteomiky exprese, purifikace a analýza rekombinantních proteinů analýza vztahu mezi strukturou a funkcí proteinů diferenční proteomika analýza posttranslačních modifikací ntMo/e MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007 Základy proteomiky 2007 zdrojová literatura Zdrojová literatura k první přednášce: Monografie a učebnice Plant Functional Genomics, ed. Erich Grotewold, 2003, Humana Press, Totowa, New Jersey Proteome Research: New Frontiers in Functioonal Genomics, ed. Wilkins, M.R., Wiliams, K.L., Appel, R.D., Hochstrasser, D.F., 1997, Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg Dubová J. , Hejátko J., Friml J. (2005) Reproduction of Plants, in Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine (ed, R. A. Meyers), pp. 249 - 295. Wiley-VCH, Weinheim, Germany Publikace v mezinárodních časopisech Wang, L. and Wessler, S.R. (1998) Inefficient reinitiation is responsible for upstream open reading frame-mediated translational repression of the maize R gene. Plant Cell, 10, (1733) Friml, J. and Palme, K. (2002) Polar auxin transport. Old questions and new concepts?. Plant Mol. Biol., 49, 273-284 Mello, C.C. and Conte Jr., D. (2004) Revealing the world of RNA interference. Nature, 431, 338-342 Surpin, M. and Raikhel, N. (2004) Traffic jams affect plant development and signal transduction. Nature Reviews/Molecular Cell Biology 5,100-109 MASARYK UNIVERSU Proteomika 2007