KURZ ZÁKLADŮ PROTEOMIKY


ČASOVÝ ROZVRH:



  PONDĚLÍ              7:50- 7:55          Zahájení praktika (UKB, A2, 2.NP,  místnost č. 211, Dr.
Hejátko)

         8:00 – 9:00          2-D elektroforéza – rehydratace proužků

                                9:00 – 9:30          Exprese rekombinantních proteinů – zaočkování
expresní kultury

                              9:30 – 10:00           Úvod do experimentální části (přednáška)

                                                            9:30-9:40       2D elektroforéza (Dr.
Konečná)

                                                            9:40-9:50       MS analýza (Dr.
Zdráhal)

                                                            9:50-10:00     Rekombinantní proteiny
(Mgr. Fohlerová)

                            10:00 – 10.50          Příprava 1-DE gelů (pro SDS-PAGE i nativní PAGE)

                             10.50 -11.20           Příprava gelů pro 2-DE

                            11:20 – 12:30           OBĚD

                            12:30 – 13:30           Exprese rekombinantních proteinů – indukce

                                                            PAGE analýza – příprava gelů (SDS-PAGE,
nativní PAGE)

                            13:30 – 14:00           In-solution proteolytické štěpení směsi
proteinů pro LC-MSMS

                                                            analýzu

                            14:00 – 16:00          Struktura proteinů, proteomické databáze

                            16:00 – 16:45           Exprese rekombinantních proteinů – sklizeň
kultury

                                                            Příprava noční kultury pro izolaci
plazmidové DNA

                            16.45 – 18:00          1. rozměr 2-D elektroforézy: izoelektrická
fokuzace (IEF)


ÚTERÝ                  7:45 – 9:15           Izolace plazmidové DNA

                               9:15– 10:00           Sekvenování – PCR

                             10:00 – 11.00         2. rozměr 2-D elektroforézy: SDS-PAGE

     11,00 – 12.00         OBĚD

      12.00 – 14.00         Barvení 2-DE gelů, densitometrie

                             14.00 – 17.00         Software pro vyhodnocování 2-D gelů, databáze
2-D gelů

                                                            Sekvenace DNA –čištění vzorku
(prostřídání skupin), nasazení vzorku

                              17.00 – 17.30        Ukončení in-solution proteolytického štěpení
proteinů pro LC-

                                                            -MS/MS analýzu

                                                            Nasazení vzorků do autosampleru a
začátek LC-MS/MS analýzy


STŘEDA             7:30 – 8:30              In-gel proteolytické štěpení proteinů separovaných 2-D

                                                            elektroforézou

                             8:30-13:00              Purifikace rekombinantních proteinů pomocí
metalochelatační

                                                            afinitní chromatografie

                                                            Demonstrační chromatografie – FPLC

                                                            PAGE analýza rekombinantních proteinů –
příprava vzorků


                              - SDS-PAGE analýza

                                                            Stanovení koncentrace proteinů metodou
dle Bradfordové


                            13:00 – 14:00           OBĚD

                            14:00 – 15:00           Sekvenování DNA – vyhodnocení výsledků


ČTVRTEK            8:00 – 9:00            Nativní PAGE analýza

                               9:00 – 11:00          Analýza proteomu – identifikace proteinů
metodou MALDI-TOF

                                                            MS  (ukončení in-gel proteolytického
štěpení proteinů separovaných

                                                            2-D elektroforézou a analýza vzorků
MALDI-TOF hmotnostní

                                                            spektrometrií)

                             11:00 – 13:00          Ukončení nativní PAGE – aktivitní barvení
(MUG)


 - Western blotting

                             13:00 – 14:00          OBĚD

                             14:00 – 16:30          Western blotting

                                                            Analýza obrazu – densitometrie.
software pro vyhodnocování 1D gelů

                              Dle dohody                                         (vyhodnocení
čistoty purifikovaných proteinů)

                                                            Vyhodnocení sekvenování DNA, čtecí
rámec (Work Bench)



PÁTEK                 8:00 – 10:00           Vyhodnocení výsledků LC-MSMS a MALDI-TOF MS analýz

                             10:00 – 12:00          “dodělávky“,  konzultace, vypracování a
odevzdání protokolů

                             12:00 – 13:00          OBĚD

                             13:00 – 17:00          vypracování a odevzdání protokolů




Cvičící (legenda):


2-DE a příprava pro MS                                             Dr. Konečná

                                                                                   Danuše
Fridrichová

Analýza obrazu                                                           Dr. Kovářová

MS analýza                                                                 Dr. Zdráhal

Struktura proteinů                                                       Dr. Janda (Dr. Marek)

Exprese a purifikace rekombinantních proteinů Mgr. Fohlerová

                                                                                  Martina Válková

Izolace a purifikace DNA, práce s WorkBench           Dr. Nejedlá

Sekvenování DNA                                                      Mgr.
Paděrová