- ^-
o1- - »
-       <
= - *                   u3       =
..- =
a - ■>=,=       .;
3  *  U        <J-o   4
genomika
■j
*   -^   w
I

V j*.

s
I
*-!_  — U
C       >-■
J  —   -1
■J       I-'
u —U
I    I   I  I „ J ji •_
Eduard Kejnovský <& Roman Hobza
■■-•O
;   11  .      -i
jjj;


*_'
Vmu\
=     5
'tu*
-X
«/V
i   L-í
-4
.í
13—1.
%. f
Kapitola II.:
W J»
P*
světa RNA
!

•   I       I    I     I    I
3^1
j        ^j—
-J m
■J      * u — u v — fl	»Zw1-                        II 3 —   AfM « L. ĽL'UUU U 1 3.    *•■      '-1
	
34UJJ4 J _><- J. .....
I


I
I
I
JjnCOj k2vH -
LOti I   :   I
íä
<..*<i;     H    -.*<<—Í»
y m
U -tí ŕ_u
.1      I      I
Ľ
O
""    ■"    « "VI
K     I-
■J - u
■C       5
*    -   _■
r«J*s\
v
^
^■j Cu ULrJ
......

— *

I   I    I   I      I
Iľ-llľ.lL. -1U
U      K*     U
I    I  I    I   I
"!!<'
^
<J  »  3
<j     1-
u —y 3 • U
u—u
«
=K*-
Í   ;
/L -u
a   fi —u S    j .O
1- < —B
1— tp     •
KV***
«* V V   u
J^                3     tí    s   *
.    ... ľ--/  .1
w - _>
Ľu _ m _ u — u
l>-8
»r   UM
Ll^l  O^*  '
I
I      I
j —  m
*—  -7,
..■       Ú
-I •   i
^
V*
U— L?
5  V
u — 1-j      3
í = u                     *»
= •   J                           U   V   t,
u— i)                              *•
■ :     m

< v*
• ...■ - 11 f — -J 3 — 4 Ľ— ti *    •    u.
■J           *
5-u
■  =. ■* * 1

•Mill
«U           1   -ii-*-ii^_i
I                  • 11   I
"%
-■>-.

■Wíy
?
-<
U    ^      3
L * -
3 • Uh44
j — —S
-■— :• u— uy
_>-■■*
J — u
*^
3U <."
Ill-
V
Svět RNA
•  co bylo dříve - DNA nebo proteiny?
•  RNA je genetický materiál i katalyzátor (Crick 1968)
•  katalytická aktivita RNA (Cech 1982)
•  RNA svět (W. Gilbert 1986) jednoduché polymery - replikátory, RNA
evoluce
autonomní organizmy jsou buněčné složitá biochemie: DNA - RNA - protein
Funkční specializace:
>  uchování genetické informace - nukleové kyseliny
> strukturní a katalytická funkce - bílkoviny
15 bíHiOn yéaí
RNA   : /DŔLD
A,
present
big bang
solar system formed
first cells with DNA
first mammals

Nucleotides  *
[A] RNA forma
[B] Ribazymes catalyze RNA replication
Mi L
^H
Protein [C] RNA catalyzes protein synthesis
ViT^
[DJ RNA encodes both DNA and protein
Can membrane
[E] Proteins catalyze cell ecllvltles
UtrrtüHÜ fi I« ttl llfc»Uj»H»J- *4C Hl BIGHTS RESEľ.ía
Důkazy RNA světa
1.  Důležitá role RNA v realizaci genetické informace dnes
(mRNA, tRNA, rRNA, peptidyltransferazova aktivita, snRNA, RNázaP, snoRNA, aj.)
2. RNA viry, retroelementy, telomery
a konzervativní mechanizmus jejich replikace
Kritéria testující zda RNA je reliktem světa RNA:
1.  Katalytické vlastnosti
2. Všudypřítomnost
3. Centrální postavení v metabolismu
DNA
Centrální role RNA v
dnešních biologických
systémech
REDUPLICATION:
primer RNAs, telomerase RNA
TRANSCRIPTION  <
6SRNA
7S K RNA, SRA RNA, Xist RNA, Air RNA
PROCESSING: sno RNAs, gRNAs, snRNAs,
RNase P, sclf-splicing introns
Regulation
Tranjs-    . peptidation ^ f
TRANSLATION
siRNA, miRNA Replication?
asRNAS (micF, CopA, OUT)
OxyS, DsrA sRNA miRNAs
Degradation
Regulation
Pozůstatky RNA světa se          Protein
dosud zachovaly a jsou skryty          4,
ve spleti buněčných procesů
tmRNA
Degradation
T/M translocation: SRP 4.5S RNA, 7S RNA
Chemická struktura RNA
Rozdíly mezi RNA a DNA:
Ribosa (2'-OH skupina) Uracil místo thyminu (absence
methylu v poloze 5)
HOCH, Ä     OH
HOCH, XL     OH
used in ribonucleic acid (RNA)
O
used in deoxyribonucleic acid {DNA)
HX
HC-ll HC.
N
H
NH
I
N„/
O
í! c.
o
NH I
uracil.
.•■■■ • -■•.    :■:                                                                               '■
used in RNA
C
II
N
I H
/thymines used in DNA
O
Důsledky:
-  Většinou jednoretezcova sroubovice s kratšími dvouřetězcovými úseky
-  Variabilita prostorové organizace druhého a dalších řádů
-  Komplexní trojrozměrná struktura
RNA může mít i strukturní a katalytickou funkci
POČÁTKY SVETA RNA SVĚT PŘEĎ RNA
Počátky světa RNA
Nucleotide structure
Base
OH    H
Sugar
Ribóza: formozová reakce z formaldehydu (Butlerow 1861), směs pehtóz a hexóz, nestabilita ribózy, Pb-katalýza, Ca-borátová stabilizace, alkalické pH
Puriny: syntéza z HCN a f ormamidu, adenin v chondritech Pyrimidiny: reakcemi mezi molekulami kyanoacethylenu nebo kyanoacetaldehydu, vyšší výtěžky v přítomnosti močoviny, výtěžky lze zvýšit zmrazovaním nebo v podmínkách vysoké energie (hydrotermální prameny)
Nukleozid: vazba bází na cukr, beta-orientace, slabý bod hypotéz
Nukleotid: fosforylace nukleozidů v roztoku CaP (hydroxylapatitu, vysoká teplota, malá účinnost), syntéza polyfosfátu, význam trifosfátu. Racemická směs nukleotidů: alfa a beta a L a Ď-izoformy
Polymerizace: pomalá a spontánní, nespecifická, racemická směs, pouze 5-3 f osf odiesterová vazba mezi beta-Ď-nukleotidy byla funkční a byla prodlužována při nízkých teplotách (led) katalyzováno ionty kovů, v hydrotermálních pramenech
Počátky světa RNA - tvorba cukru
(formozova reakce)
Riboza: - formozova reakce z formaldehydu (Butlerow 1861), směs tetroz, pentóz a hexóz, nestabilita ribózy
- Pb-katalýza, Ca-borátová stabilizace (pentóz), alkalické pH
-  Tautomerizace: aldehydy - ketony
formaldehyd
glyceraldehyd
v
I
H-C-OH CH2OH
1
Tetrózy, pentózy, hexózy
//
glykolaldehyd
CH2OH*CHO 2   CH£OH»CHO
formaldehyd ch2o
CH2OH-CHOH-CHOH-CHO
CH2OH*CHOH*CHO
It
CH2OH-CHOH~C-CHsOH   -*
tetróza      o
CH20
I
CH£OH-C-CH2OH II
glyceraldehyd
FIC 1, The simplest hypotheticalautocatalyiic ľormose reaction cycle. In each turn of the cycle, a glycolaldehyde molecule facilitates the synthesis of a second glycoJaldehyde molecule from two formaldehyde molecules. The stereochemistry at the asymmetric carbon atoms (marked with asterisks in the diagram) is not specified.
Počátky světa RNA - tvorba purinu a pyrimidinu
Syntéza adeninu: z kyanovodíku
(a)   CN- + HCN       H<  > BN=C-CN    HClV>   NHs-CH
NC              NH2
CM             NC               NHZ           ,   , -,, .
HCN, Y       HCN tetramer
KGN             NC               NH2
(ty                                    HN=CH-NH2
NC              NH2 /
V\   Amino-cyano-imidazol (AICN)
H?N^N
H
(c)
HCN
i) HjjN-^^N
*           H
II
C2N2
NHa                                         NH2
fSr>    rv>
h
H2N     ^N'
H
H20
CNO-
0 II
HjN-C^^^-N.
:x>
H3N        N
£            H
in
C2N:
puriny
HCN
>
FIG, 2, Stepí in possible prebiotic syntheses of adenine from HCN. fa) The formation of the HCN retrained (b) The conversion of HCN tetrajner to AICN. (c) The formation of purine? from AICN or from its hydrolysis product 4-amino -imidazole- 5- carboxami de f][])-
Nízká efektivita a specif i ta syntézy nukleotidů vedla k navržení alternativních genetických systémů
cyanoacetylén
(a)          HC-C-C-N ——■*■ OHC-CH2-C~N
(b)
IV
HNCO
HC-C-C«N ---------*- OCN-CH=CH-C = N
NH2-CH=CH-CM
HNCO X^                                       '   "
NH2    ^                 'i
H                          H
IM                                     Kl                               NU,,
III                                J
,   ,              NH2    ^CH£               NH2 V,|                fŕ^
(C)               1              1        —*   I                —*  i
H2                                H                           H
FIG. 3.    Steps in proposed prebiotic syntheses of cytokine.
(a)  The hydrolysis of cyanoacetylene to cyanoacetaldehyde.
(b)  The reaction between cyanoacetylene and two molecules of cyanic acid, (c) The condensation of cyanoacet aldehyde with
Syntéza cytosinu:
- z cyanoacetaldehydu nebo cyanoacetylenu
1.
2. 3.
A biotická syntéza nukleotidu a polynukleotidu
Syntéza nukleozidu: vazba bází r\a ribózu
Tvorba nukleotidů: fosforylace nukleozidu (racemát)
Tvorba polynukleotidu - tvorba fosfodiesterove vazby
H-i
NH2
I
II      iC-H t *C    *'
O           O           O
I        I        I
O— P— O— P— O— P— OCs-H! I             I              I
O           O           O
fir.
H    Cj-------C/   H
I
I
HO       OH
Chemická kondenzace aktivovaných 5'-polyfosfát nukleotidů
Nekatalyzovaná
0 = P-0
"b
0 = P-0
OH
0=P-0-
H 5'-2'
OH   |
N,
/
=P —O—i           i
5-3' n
o=p-o
r ICJ
H
O-P-O-P-0
OH
5'-5' -
OH  OH
OH OH
OH  OH
H"
O—P-O—P—o
OH
y-
|      OH
O
I
0-P=0
I
N
OH
0 = P-0
tí
OH  OH
0~P=0
0 = P-0
N
tí
OH OH
(
Katalyzovaná
povrch montmorillonitu jcatalyzuje oligomerizaci)
Zn&+
5'-3' cukrfosfátová páteř oligoribonukleotidu
Prevaha 5'-3' až 40-mery
5'-2' cukrfosfátová páteř oligoribonukleotidu
Neenzymaticka replikace RNA
a tvorba dvouřetězcové RNA
Zrod replikace (4mld)- komplementarita - neenzymaticka syntéza dle templatu
Většina aktivovaných nukleotidů tak činí jen velmi neochotně
Tvorba dvojvláknových i trojvláknových struktur
Úloha kovových katalyzátorů, zvláště Pb2+, montmorillonitu, uranylových iontů
Koevoluce RNA molekul r\a minerálu, později enkapsulace v membráně?
5' (p}                           3'
templát             aktivované monomery
templát
kopie
Kondenzace oligoG podle polyC templatu dvou- nebo troj-vláknové komplexy
Ligační reakce - zvýhodnění vazeb 5'-3'
Nejlépe je-li dsRNA v A-formě
Spontánní syntéza prvních RNA
syntéza první DNA
Ribonucleotides
Primordial RNA
molecule
New
complernenaiy
copr
ftlbwiLKlftOlldtl
-f T
Dww^rftbonuclKrtJ d«
lUduciton    -r t f.
TT
T     T
Hnr»
triracrlpooíl
Codlnf ANA
DNA
Předchůdci molekul RNA
RNA
o-
Ci-
ÜH
Ov ^B
homo-DNA
I
o
o
0=L
O             OH
I

O'
o
p-RNA
O   j -o. I! JO
I
TNA
I
V
-O       0
B
o     o
v r \
V
0 r°
C
G
^P^
H0^N^8
PNA
— NH
w
O
NH

-MhJ
•Genetické systémy bez fosfátu (jiná páteř):
•homoĎNA - založená na 2,3-dideoxy-Ď-glukóze
•  pRNA - založená na pyranosylu
•  TNA (threose nucleic acids) - tvoří dvoušroubovici
•  PNA (peptide nucleic acids) - achirální, směs pravo- i levotočivých helixů, tvoří dvoušroubovici s NA - přechoc
•  Minerály, jíly (Cairns-Smith 1982)
MN
X X
Iß)
(b)
ANA
FIG. 10.    [a) The amino acids that are combined to form ANA.
B designates a standard nucleotide base, (bj The proposed base-paired structure formed by alternating ANA peptides. (Redrawn with slight modifications from. Diedenchsen, U. (1997). Alanyl PNA: evidence for linear hand structures based on guanhie-eytaBine base pairs, Angew Chem Inil Ed Engl .16(17): 1886.)
C
QU
M
L.H
~>

..:-■■£      °
oS-f
Y"
eooH
PROTEIN
NH         j-"G  :'~
sin      r
Ca
CONH ;
DNA
PNA
Alternativní genetické systémy - pRNA (Pyranosový analog RNA)
-  Furanosová forma r i bosý nahrazena pyranosovou
- Watson-Crickovské párování stabilnější než u RNA
- Menší pravděpodobnost tvorby víceřetězcových struktur
-  Stabilnější než RNA
- Pozvolnější stoupání dvousroubovice => snadnější separace řetězců při replikaci
- Genetický systém - skvělá volba
- Nemožnost postupného přechodu r\a genetický systém založený r\a RNA
Alternativní genetické systémy - PNA (Peptidová nukleová kyselina)
- Nenabitý a achirální analog NA
- Monomery spojeny peptidovou vazbou
- Tvoří stabilní heteroduplexy s RNA i DNA
- Prokázán přenos informace PNA->RNA i RNA->PNA
- Možný postupný přechod na RNA svět
- Aktivované monomery ochotně cyklisují; obtížný vznik oligomeru v prebiotickém světě
Alternativní genetické systémy:
Svět polycyklických aromatických uhlovodíku (PAH)
Molekuly RNA:
- chemicky nestabilní
- strukturně složitá
Požadavky na primitivní
- strukturní jednoduchost
- schopnost párování
- stabilita
RNA KATALYZÁTORY - RIBOZYMY
Katalytická RNA
Objev:
- Thomas Cech - intron I. typu v 26S rRNA u Tefrahymena, samosestrih (1982)
-  Sydney Altman - RNasa P u Escherichia coli, zrání tRNA (1983) -1989 - Nobelova cena za chemii
Ribozymy:
- molekuly RNA oplývající katalytickou aktivitou
- obecně analogy bílkovinných enzymů
- aktivní v několika základních reakcích metabolismu RNA a syntézy bílkovin
- pozůstatek z RNA světa ?
(A) A rlboEyinft chat is ako a coding moJecule
(B) A ribozjfme that syniheslr« codttg nwl«ul«
Adaptor RNA
Am hid acids
VA
I-  ,*      flitKjnydeovd«
fliboiym* ctHTipůnenT
Coding component
RlbOzyriM
*
\
' '.........   Coding UNA
\
(a) Kódující RNA je součástí ribozymu
Adaptor RNA
(b) Ribozym syntézu kódujícTRNA
Amino acids
,i..i.
it«
Co dokazí RNA katalyzátory
Katalyzované reakce - substrátem většinou RNA:
1. nejcasteji místně specifická hydrolýza fosfodiesterových vazeb
a) endonukleasa
b) c/s-reakce - ribozym i substrát povodně součástí jediné molekuly
c)  /Ttf/75-reakce - ribozym i substrát povodně různé molekuly
2. obrácený směr - syntéza fosfodiesterových vazeb
RNA ligasa, RNA polymerasa (malá procesivita), nukleotidyltransferasa 3. transesterif ikace sestřih, editace
Substrátem r\erú RNA !
1. hydrolýza aminoacylesterových vazeb
2. syntéza peptidové vazby - 28S rRNA
RIBOZYAAY: 3
1. „Hammerhead" ribozym Odvozené typy:
>  Vlásenkové ribozymy
>  Hepatitis 5 virus ribozym
>  replikace genomove RNA rostlinných viroidů (vlásenkové ribozymy) a viru hepatitídy 5 u savců mechanismem valivé kružnice
>VS ribozym (Neurospora crassa)
> vznik monomerů ssRNA, templatu pro reverzní transkripci RNA
Varkud satelit plazmid (mt u N. crassa)
150b, transkript, ligace a štěpení
archetypy
2. Introny I. typu Odvozené typy:
> Introny II. typu
> samosestřih
>  U6 snRNA
> spliceosomální sestřih
3. Ml RNA (RNA složka
RNasy P)
Odvozené typy:
> RNA složka RNasy P jiných organismů
99
Hammerhead" ribozymy

■
\ Loop III
Helix II
N
Helix III   N
N
'TM N N N  G
A   A  -
-N N N N
Loop II
C N
U    N C      N
Catalytic     *
A C
N A
N N N U
H
N N N N
i
5' 3'
Helix I
core
J Loop I
- tři dvousroubovice stýkající se v konzervovaném jádře 13 nukleotidů
- nejjednodušší popsaná forma katalytické RNA
- popsán v ssRNA genomech rostlinných patogenů, viroidu a virusoidů, satelitní DNA čolků
- replikace mechanismem valivé kružnice
- štěpení konkatemerů
-  kata lyžuj í i opačný směr reakce - ligaci
- přirozená aktivita v cis, v umělých molekulách i v trans
krystalová struktura - tvar „Y"
Vlásenkové (hairpin) a VS ribozymy
vlásenková struktura, odvozené z ribozymů hammerhead antivirové aplikace, HIV-1, ligáza při manipulacích s RNA
R) Huirpiii Rlho/ynu-
UUUtlĽCL        ACACUa
I 1 H I í          lili       -j-
.<jAAACA(lA        AQUCAA   Uň
AOAť
c-ti
Aü-fc
A                U
C                 *■
A-U
c-a o    u
u
CHA
m =INA_
An RNA copy li made frsm tne D^A which would twrmallií wtv* u a template tor a protein
.___...bnguc....
'Hairpin' Castle HNA
•/^
RBCMjnrtnin HsjUEiee
T-K -hairpin" UNA bind» to the aLbalratc ucogiltlan »qUHTK»
ľlWhalipliľ'RHfllí recycled Id ceflalyre
mother c leava ge i Mellon
vlasenkove
Cleavage'by Hie linlrpln' catalytic R NA disables I he řutilrď» FÍHA thwiby b locking the p roductbn o' a protein
.tall
guc„
Varkud satelit
5 helixů three-way junction
Ribozymy: introny I. skupiny
- v genech pro tRNA, rRNA i mRNA                                  1982 "Thomas Cech: sestřih .III    Lv„lij.          lix    • x'                                pre-rRNA prvoka Tetrahymena
-  mt hub, cp ras, bakterie, baktcnofagy     ^                     thermophilic!
- „homing", gen kódující „homing endonukleazu (HE6)"   _ samosestřih
-  dvoukrokova transesterif ikace, bez energie
- guanosinový kofaktor
-  manipulace aktivního místa umožní trans reakci
■OH
i
O,
-----P--------- HO^ff
Sekundární struktura int"onu a internal guide sequence (\LG5)
o
,j
■í>   Uň    —
5' Exon
lili
Ö    O
Životní cyklus      PrecursorRNA a homing
No intron
Precise loss
Intron invasion .and fixation
Intron loss
Precursor RNA
Intron with nonfunctional HEG
S>
HEG--
Homing
Precursor RNA
Functional mobile intron
0
or
HEG
Loss of HEG function
TRENDS in Genetics
Ribozymy: introny II. skupiny
méně rozšířené, odvozené, bakterie, organelové genomy eukaryot
adenosinový kofaktor
„retrohoming" - inserce do alel bez intronu, reverzní transkripce
Sestřih
2fr6'-PhosphodífV3ter band
Tů3" end
Adenosine in the lariat structure? has three phoEphodiester bonds.
5' Apíice xile 5' exon
\
•■•;-_■■■       branch site
i si step
^^H 3' exon
5' splice site cleavage u  and lariat formation
Ck
■ 3-          *  l==
3' splice site
2nd step     exon
o
ligation
3' í'*------CH
Reverzní sestřih
A    Reverse splicing
D     Antisense strand cleavage
C    cDNA synthesis
D
f     \                  exon
RT   ^--------^      +   DNAtargetste
rntron RNA
■f 3'
5' E
intron RNA
5'E
Recombination /Repair_______
mtron RNA
I

I
s-e
.hilu,i.iiii.ff,.
Introny I. a II. skupiny: „Homing" a „retrohoming"
Reverse transcriptase copies the inlron into a pew sire
An intron codes for an endo nuclease that initiates its transfer
Exon
Intron
*
Exon
Target site
___ RNA
Homing
4
Endonuclease      cleaves target site

Intron copied into double-strand break
■virtuaJtext www.ergjto com
*
Exon          Intron                   Exon
4
*
RNA
Targel site
4  ľ
Double-strand break provides prirning
Endonudeaseŕ Reverse transcriptase
cDNA grows from 3"
i

-OH
Intron RNA is template
A    *
yXWA^VX
Retrohoming     rp^T^
Mmjj
DMA replaces RNA
/^^AVAVAyAvA^VV
Intron necombtnes
■■■■illUahEil   'VAVi &ľCJ]tO CDT.
RNáza P
Zraní tRNA:
odštěpení 5'-leaderu za vzniku zralé tRNA (1983 S. Altman)
Specifické vlastnosti:
ákutečný enzym - opakovaná aktivita v trans
Rozpoznání substrátu na základě struktury a tvaru (ne dle párování bází)
Nukleof ilem je hydroxylový ion OH-
RNáza P osahuje RNA i proteinovou složku:
E a?//VRNA + jedna bílkovina, katalytická aktivita čisté RNA prokázána H. sapiens: RNA + tři bílkoviny, katalytická aktivita RNA neprokázána
RNase P Recognition
pre-tRNA
wer3 \A
tRNA
RNase P Holoenzyme
ĎNAzymy - enzymaticky aktivní DNA
- připraveny in vitro selekčními metodami (SELEX)
- „10-23" deoxyribozym, katalytické centrum (15bází) + dvě ramena vážící substrát, štěpí RNA
- výhody DNA: tvorba ĎNAzymů rezistentních k nukleázám, sekvenční specificita
- tvorba molekul DNA podobných proteinům (báze s postranními AK řetězci, OBR.)
- antivirové, proti HIV-1 RNA,
- cílené proti „rakovinovým" genům
y
"10-23" UNAzyme
I
GGAQAGACjAUG(ÍIjUGĽOj
11 1111 11 11111111
.CCTCTCTC   ACCCACGC,
A       G
<i            Q
C              C
A                 T
A                A
C            G
A T C
SELEX: „evoluce in
A.
In vitro Selection of an RNA-Aptamer
DNA synthesis:
_ErimerL^_________
primer2
/n vitro-transcriptioi
t
amplification by PCR (mutagenesis)
^*£±
^
selection
(z.B. nitrocellulose filter binding,
binding to immobilised
proteins etc.)
*l
/----------------------^^reversetranscription
cloning                                           using primer 2
sequencing
vitro
B.
- viry pro genovou terapii
- mutace plástového proteinu
- rezistence k protilátkám
- produkce supervirů
EVOLUCE:
1.  dědičnost
2.  variabilita
3.  selekce
Osud RNA katalyzátoru po převzetí
jejich funkce proteiny
1.  Vymizely:
2.  Převzaly nové funkce:
- přeměna ribozomu a tRNA účastnících se replikace na součásti translacní mašinérie
- protospliceosom měl povodně úlohu v rekombinaci, bimolekulární sestřih
3.  Zachovaly si vysoce konzervativní funkce:
- snoRNA - procesing rRNA
- RNAza P - procesing tRNA
- snRNA - sestřih intronů v mRNA
-  Tyto funkce vysoce konzervativní, zachovaly se u eukaryot
- ztráta některých RNA reliktu u prokaryot, proteiny jsou účinnější
- podpora představy progenitora podobného eukaryotům
PŘÍKLADY RELIKTU SVĚTA RNA
Představitelé reliktu světa RNA
1. tRNA - od replikace k proteosynteze
2. Ribozóm
3. Sestřih a snRNA
4. Maturace rRNA a snoRNA
5.  Maturace tRNA a RNázaP
6. Signální rozpoznávací částice a srpRNA
7. Editace RNA a řídící RNA (gRNA)
8. Telomeráza a telomerická RNA
9. Vault RNA (vRNA)
Starobylé struktury:
Ribozóm - proteosynteza, účast rRNA, tRNA a mnoha
proteinů         (původně replikace)
Spliceozóm - sestřih pre-mRNA, účast snRNA a mnoha
proteinů       (původně rekombinace)
Snorpozom - sestřih pre-rRNA, účast snoRNA a mnoha
proteinů
1. Role tRNA a ribozómu: od replikace k proteosyntéze
Dnešní translace - složitá koordinovaná síť interakcí RNA a proteinů -vyvinula se z mnohem jednodušších systémů existujících ještě ve světě RNA (RNA-RNA interakce), důležitá schopnost replikace Prvotní funkce ribozomů - polymerizace nukleotidů - RNA replikace
Původní role ribozomů v replikaci:
- Ribozomální protein SI a translační elongační faktor Tu a Ts - jsou podstatnou složkou replikázového komplexu fága Qß
-  Elongační faktory jsou složkami replikázových komplexů některých rostlinných RNA virů
Hypotéza genomových značek:
Molekuly primitivních tRNA fungovaly jako značky molekul RNA určených k replikaci RNA ribozymy, TLS (tRNA-like structures) - na 3-konci Qbeta Aminoacylace tRNA - další značka
Pozůstatky replikační role tRNA v
dnešních genomech
1.  Telomeráza:
krátký fragment RNA funguje jako templát pro RT
2.  Retroelementy:
tRNA funguje jako primer syntézy cĎNA při reverzní transkripci
3.  RNA viry:
struktury podobné tRNA na 3-koncích genomové RNA
TLS (tRNA ji ke structure) jsou aminoacylovany histidinem, valinem
nebo tyrosinem a fungují jako primery replikace RNA,
jen 3-koncové CCA nebo CCCA jsou potřebné pro replikaci
2. Ribozómy: ribozymy stabilizované
prokaryotický ribozóm
proteiny
o
malá podjednotka
velká podjednotka
16S rRNA (1542 b)
5S rRNA (120 b)
32 proteinů (L1-L34)
21 proteinů (S1-S21)
SI - role v
řep I i kazovém
komplexu fágů
peptidyltransferazova aktivita
235 rRNA C2904 b)
L2 - někde převzal PT roli
2. Ribozómy: ribozymy stabilizované
proteiny
br\ešr\'\ ribozóm:
- RNA-RNA interakce: tRNA - 23S rRNA
- peptidyltransferázová aktivita rRNA
- u některých organizmů převzal tuto roli ribozomální protein L2
Protoribozóm:
- představa ribozómu tvořeného pouze RNA, in vitro experimenty
- povodně odlišná funkce, replikace
- velikost 7500 nukleotidů (Eigenův limit)
- povodně možná více ribozymů
- RNA je schopna aminoacylace tRNA
3. Sestřih, spliceozóm a snRNA
Spliceozónv
- posttranskripční úprava pre-mRNA (hnRNA), vystřižení intronů
- obsahuje RNA struktury podobné intronům II. skupiny a hammerhead
-  RNAjRNA interakce
- starší než translace - původ v rekombinaci molekul RNA
-  bimolekulární trans-splicing molekul ssRNA
Eion 1
PNA Irnisortpl (piD-mHNA)
In trón
Era r» 2
Prettin snflNA
ar n MPs
/
OtíiBř proteins
5p   Ľ■::■■ vrv-
'i. v%
Spl|CttJ90fflO
companonls
Elton 1
Ezon ŕ
:ii>-i..k-.-,-M....-,i..v- -■ r.
5" splice site
5' exgn sequence,
UlsnRNP
inlfon
sequence
U2 snRNP
3' spliw sita
3' exgn >;.-i|iii!:i: i!
3'
precursor mRNA rfiĎlôtulo
ASSEMBLY OF
SPUCEOSOME
STEPI LARIAT FORMATION
and 5-splice site Cleavage
U í
U1/U6
STEPI 3' SPLICE SÍTĚ
CLEAVAGE AND EXON SEQUENCE LIGATION
excised intra n sequence
in iho form of a lariat
(will be degraded in nucleus-}
OH
■y ■[
I J'
■ .-.-■_-.- mRNA (ligated exact
SBquerlc«]
Malé jaderné RNA (snRNA)
nacházejí se v jádře eukaryot
účastní se sestřihu pre-mRNA a udržování telomer
tvoří nukleoproteinove částice (snRNP = snurps), každá s více proteiny
jsou kódovány introny
Ul, U2, U4, U5, U6 U4+U6 se párují spolu a U6 je katalytická
Roles of snRNPs
•  Ul snRNP binds 5; splice site
•  U2 snRNP binds to branch point
•  U4/U6 snRNP. snRNAs are base paired, Uó is catalytic
•  U5 snRNP contacts the 5'splice
(jfk    site
- tomis tri-snRNP complex with U4/UŮ
Assembly of the spliceosome
Ul snRNP
Branch point
Ssplice site
~&
'3' splice site U2snRNP
u
5 snRNP U4/U6snRNP
O
,_ LsiTt J L
Ul EiiRNA
GUCCAUUCAUA Cap 5" 'M
3"-,    L
U   U
u _ u
UÍSnRNA      g_£
C-G U       U V     U A-U
p__f-
A CUA-UCUAAGCA cap 51 GAUGU
Pv             __________
Exon 1
Pre-mRNA
iL
UAOJA * i A
—          ---- CA Gl
Branch point
y
bKon 2
Malé jaderné RNA (snRNA)
L-SS                       bp              ďSS
4. Maturace rRNA a snoRNA
snoRNA (malé jadérkové RNA):
- účast při maturaci rRNA a ribozómů
- velký funkční komplex - snorpozóm
-  kódovány introny některých genů - ribozomálních a heat shock genů
-  8 různých snoRNA kódováno 8 introny jednoho genu
- u sa\/ců nejméně 30 různých snoRNA, u kvasinky 26 snoRNA délky 5426 b (ancestrální snorpozóm)
- homologie snoRNA s rRNA (18S a 28S), intra- i intermolekulární kontakty (kroslinkování)
- některé snoRNA potřebují spliceosom ke své maturaci
Prokaryota:
- absence snoRNA u prokaryot je záhadou
- maturace rRNA jen za účasti proteinů
- objev U3snoRNA u archebakterie Sulfolobus acidocaldarius
Malé jadérkové RNA (snoRNA)
- jsou součástí snoRNP (snorpozómu)
- snoRNA hybridizuje k cílové sekvenci rRNA, modifikuje, štěpí prekurzorovou RNA, sbaluje do terciálních struktur
- geny pro snoRNA se nacházejí v intronech (potřebují sestřih, spliceozóm)
- účastní se modifikace rRNA a dalších RNA genů (např. metylace)
,......j
i-í
t  í
■:;.:
f-;
'V>.

!!í
!?      Ě3!l!ill'ÍCS[CI
ŕ»
^fij^P

s»     ,™.

M
iUCßMp-B^
íl ...
i
-
;
ip-
£ = i S:S,
u      Sec
i=1
f   111*11«        ,x
Jf
M

i-E

OS

C?
Struktura rRNA
#■
EXON
ICONIC SfloR NA        3
Sfi o RNA folding
I        EXOH
accessory pf ote ins
EXQN        I
-I        EXQN     1
snoRNP transport
Tvorba snoRNA
jadérko
Introny jsou někdy důležitější než exony (snoRNA v intronech)
- gen UH6 (U22 host gene) obsahující v 8 intronech 8 různých snoRNA
- sestřihem vzniká mRNA, která je však degradována
- mRNA je málo konzervativní mezi člověkem a myší
- hlavním funkčním produktem UH6 genu jsou tedy molekuly snoRNA
Tycowski et al (1996): A mamalian gene with introns instead ofexons generating stable RNA products. Nature 379: 464-466.
5. Maturace tRNA a RNázaP
tRNA:
- relikt světa RNA - konzervativní, všudypřítomná, centrální úloha v metabolismu
-  interakce s rRNA (CCA konec tRNA interaguje s 23SrRNA)
- povodní funkce v replikaci, později v proteosynteze
- některé geny pro tRNA mají introny
RNázaP (6uerrier-Takada, 1983):
- úloha v maturaci tRNA
- je skutečným enzymem, štěpí opakovaně
- RNA katalytická podjednotka (Ml RNA) -molekulární fosilie
- jediný ribozym modifikující RNA u prokaryot
RNáza MRP:
-druhá podobná molekula vzniklá duplikací a divergencí u eukaryot nebo endosymbiózou
- výskyt u Siardiaa Microsporidia - nemají mitochondrie
RNázaP a její RNA složka
6. Signální rozpoznávací částice a srpRNA
RNA-proteinový komplex zajišťující vazbu ribozomu na ER a sekreci proteinů RNA složka 7S RNA u eukaryot a archeí, asi 300 b podobná struktura a funkce, homologie s Alu sekvencemi stimuluje hydrolýzu GTP povodně ribozym štěpící GTP
Mammalian Signal Recognition Particle
proteiny
DA C      C
a    c
CuCuGjCC.    AGC6A      ,CG GUCC GACCU^ACGUCAC C6A   " C-GG ciľ)      ^^^G            a
srpRNA
Translation Regulation
Protein Translocation
Signal Recognition
Schematic representation of the mammalian SRP depicting SRP9, SRP 14, SRP 19, SRP54, SRP68, SRP72 and SRP RNA. The part of SRP comprising SRP9/14 complexed with RNA forms a distinct structural domain known as the Alu domain due to homology of the Alu family of RNA sequences with the Alu family of repetitive DNA sequences and the small cytoplasmic Alu RNAs (scAlus). The Alu domain of SRP mediates the specific pauses(s) in the synthesis of nascent ER targeted proteins whose signal sequence has been bound by SRP54.
7. RNA editace, g-RNA, editozóm
- posttrankripční úpravy - modifikace tRNA, rRNA a pre-mRNA,
- substituce, inzerce, delece, kryptogeny, templatem je guide RNA (g-RNA)
- eukaryota, mitochondrie trypanosom - inzerce či delece polyU
- editace je podmínkou tvorby sekundárních struktur bez nichž nemůže dojít k maturaci tRNA RNázou P
Původ editace:
- u mitochondrií - reakce r\a asexualitu (Mullerova rohatka), korekce
- ve světě RNA - editace jako kontrolní mechanizmus exprese tRNA
- nádorová nebo neurologická onemocnění (epilepsie)
kryptogen
gRNA
po editaci jiné pořadí A K
Amino acid sequence encoded
Lys     Val      Glu      ten      Leu     Val   -*-----------------   in gene
5'...AAAQTAGACAAC[TGGTACG...3'      DNA
Transcription 5'...AAAGUAGAGAA[GUGGÜAGG...3'     pre-edited RNA
t
3J...UUAUAUCUAAUAUAUGGAUAAUAU...5' Ciride »PTA
I I I I     I I  I ++ I+ It I I I  I I  I I I  I I
5'...AAAGUAGA          G      A      ACCUGGUAGG...   ■*------(pre-edited RNA
spread out to show alignment)
f
Editing
5'...AAAGUAGA          G U AÜ AC C U G G U AG G...3'   Edited RNA
Translation of edited RNA
♦'
(bs)   fValWtepMCysMlte)   (rraH^MArg
Amino acid sequence in the protein
8. Telomeráza
- problém replikace konců lineární DNA u eukaryot - RNP komplexy
- RNA složka jako templát pro syntézu telomerických repeticí
-  RNA složka tvoří terciální strukturu,účast v katalýze r\e]asr\á
- nepřítomna u prokaryot, cirkulámí genomy
- mutace telomerické RNA vede k prodlužování telomer
- homologie s reverzní transkriptázou
- starobylé RNA genomy byly lineární --> podpora hypotézy genomových značek
9. Vault RNA
- přilepena na povrchu jaderné membrány a asociována s komplexem jaderných pórů
- funkce neznámá, spíše funkční než strukturní (exp. odstranění RNA)
- souvisí s rezistencí rakovinných buněk k léčivům
- obsahuje RNA, sekvence konzervativní
- tvoří značku pro transport NK z jádra a do jádra
- v RNA světě existovala proto-jádro a proto-plazma, aby separovaly replikaci a transkripci, omezení šumu
"PW>ň
v
13
3' U U-l^
'"e-8
C -ä
e-G a-u
(J -150
C-Ü
U-G
Aů-C C-G
a -* ° " £ y™ :A                          O .
C
* G U f:
L
C
ifi       r- ^ V Ö U r- .-.           ,, C
M\   U             CSSlu
U   "^   En''*
euvV

iM    11 c
fiö     U ľ-U i í      A
G^GCCU
;U "f T
C
A A
Provázanost ribozymu
snRNA (splíceosom)
snoRNA (snorposom)
,   rRNA (ribozóm)
snRNA jsou potřeba pro sestřih
snoRNA, které se nacházejí v intronech jiných genů
snoRNA jsou potřeba pro sestřih rRNA
Fylogenetický výskyt fosilních RNA
Nekódující RNA: důležité regulační funkce
Df
řN^riu
'1 t
|M


Cxan            Pntcori
\^^vyn>v%/'
Při n*i ryto« l»rmnpl
r
Spljdnc
i
I
JtHuiiUfUfiignicRHi
i litrom RH*.
1
WiWrnnnflif
TiTTin
F(*í*S5Jlit
L                 Prfli4H-!nj
D*Fjn<itd jndí*: jjiľl*d
1
T***             HúIKcdblF
iJaiKodbiF, AIM
]

AiAfittont
Uiľ.ir
CtTtlif
RNA regulace - nová genetika
podíl ncRNA vzrůstá v evoluci
vznik nového regulačního systému v době kambricke exploze
Nekódující RNA
500C -i 4500 -
4CD0. -35DG -MOO -
2&DG -
2c-no -
1500 -
1CDG -
5D0 -
D -
1. Transferová RNA (tRNA)
2. Ribozomální RNA (rRNA
3. Netranslatovana oblast mRNA
4. Malé jaderné RNA (snRNA)
5. Malé jadérkové RNA (snoRNA)
6. Micro RNA (miRNA)
7. Guide RNA (gRNA)
8. Ef ference RNA
9. srpRNA
10.  pRNA
ii?
D P j-.3t ^e nc^NAs witn rn known function
D rRHA&, snRNAs and nther nc-RNAs with known funDtion
DmiRNAs
■ &noRNA&
■ tRNAs
1939
2004
~,~.Ž\Z: S. Jŕ.if !■?$
První RNA replikáza
Molekula RNA, která katalyzuje svou vlastní replikaci
Nutné předpoklady:
>  RNA dependentní RNA polymerasa
>  Autoreplikace
>  Syntéza potomstva musí být rychlejší než degradace rodičů
>  Dostatečná přesnost, ale ne absolutní (možnost evoluce)
Molekula RNA je schopná splnit všechny podmínky > chemismus podobný aktivitě ribozymu (intronu) I. skupiny
> experimentálně ověřeno
Vznik první RNA replikasy -          imm
jeden z nejslabších článků teorie RNA světa
První protein: RNA-dependent™ RNA polymeráza (RNA replikáza)
RNA    --------->       RNP---------      protein
Proteiny zvýšily účinnost ribozymu
- první geneticky kódovaný protein vznikl náhodou
-  krátký peptid strukturně jednoduchý
-  interagoval s RNA replikonem, zvyšoval jeho stabilitu či zlepšoval konformaci
- syntéza potomstva musí být rychlejší než degradace rodičů
- dostatečná přesnost, ale ne absolutní (možnost evoluce)
RNA polymeráza   ---------------------►    Reverzní transkriptáza
PRVNI RNA ORGANIZMUS,
VIRY, PŮVOD PROKARYOT
Hypercykly
Kolokalízace a koevoluce,
holá RNA na povrchu
minerálu
semipermeabilní membrána (pak až přechod k proteinům)
(M. Eigen)
Původně jeden člen -duplikace a mutace - dva členy ...

RNA-1 RNA
-1           L<       RNA-2 RNA-2
RNA-4 RNA
\0>
RNA-3 RNA-3
Eigenuv limit: replikačni přesnost je
limitujícím faktorem
(Eigen, 1992)
• Definice:
Cím je vyšší frekvence chyb při replikaci, tím menší genom může projít do další generace
• Omezení katastrofických dopadu chyb replikace:
- více kopií (ploidie)
- rekombinace
- fragmentace genomu do chromosomu


tt
TÄe Darwin-Eigen
Cycle
%
\
%
9
Č
\ g
7*8
&&
S?
První RNA organizmus kódující proteiny: Mborgis eigensis
(Jeff ares 1998) První RNA genomy replikované RNA polymerazami - kódovaly 1 peptidový řetězec
Množství chyb -> populace lišících se molekul RNA -> koreplikace vzájemně výhodných lineárních molekul kódujících:
- řep I i kázu
- ochranný plášťový protein
-  konformační podjednotku.
Vznik f ragmentovaných interagujících genomů (podobnost struktuře eukaryontního genomu - původní, prokaryota odvozená)
R. eigensis ~ 15kb genom
0.95
0.70
Riboorganísm
jfv RNA polymerase ic            ribozyme
VS ribozyme H* = 0.053
Hairpin ribozyme ^ = 0.144
j---■■■diiiU^^
■    L-----J-......___•___I___-      ■      -      ■    -    ■------J   ■--■-----1----1—1—1—L___.___-       -       J      ---J------1.----■-----I--I----1—1—
^%J
<3\<£
#<r

# _#
Dnešní viry: Funkční relikty časných
replikonu?
Pohled na viry:
- molekulární paraziti, odvození v důsledku způsobu života
- primitivní, na hranici života podobně jako časné replikátory
- funkční relikty x funkční modely RNA-proteinových replikonu
RNA viry:
- minimální kódující kapacita
- některé viry střídají fáze RNA a DNA - reminiscence RNA->ĎNA přechodu
- primerem replikace je tRNA
Mimiviry - hranice života:                      \~
- velikost genomu srovnatelná s prokaryoty (1.2Mb)
- metabolické geny (911 genů pro proteiny)
-  10% repetitive DNA
- jen částečná závislost na hostiteli (proteosyntéza)
I
Mimivírus
Eufcar/J
Archatu
Bacteria
\s • \s *    \s
Viroidy: nejpodobnější casnym
repl ikonům
- patogeny rostlin
-  200 až 10 000 kopií r\a buňku
- malé RNA genomy (240-400 b), ssRNA, cirkulární,
- nekódují proteiny - jako replikony éry před proteiny
- replikovány hostitelskými RNA polymerázami
- rolling-circle mechanizmus
- multimery štěpené autokatalytickými ribozymovými sekvencemi
-  intenzivní vnitřní párování bází jejich genomické sekvence
- tvorba sekundárních struktur stabilizujících genomy
LH terminal domain
Pathogenic domain
Conserved central domain
Variable domain
RH terminal domain
CC CCGG
GG   GGCC U
imföivl
240 bp potato spaidle -tuber viroid molecule magnified 440000 time!.
Svět RNA podporuje představu starobylosti eukaryot
1.    Mnoho reliktu světa RNA u eukaryot (snRNA, snoRNA, gRNA, telomeráza), jen některé také u prokaryot (RNázaP, tRNA), proč by účinnější proteiny byly nahrazeny molekulami RNA
2.  Posttranskripční úpravy mRNA a rRNA jsou rychlé a účinné u
prokaryot
3.  Neexistuje selekční výhoda pro moderní vznik sestřihu a
spliceosomu u eukaryot, složitější struktura, mRNA za lhod místo za 1 minutu
4.  Eukaryoticke telomerazy jsou starobylé struktury, homologie s RT
Původ prokaryot a hypotéza
„termoredukce"
- v evoluci prokaryot bylo stádium termof ilních organizmů
- malá stabilita RNA při teplotách nad 50°C
- časové i prostorové oddělení transkripce a translace nevýhodné -degradace RNA
- odstraněním intronů odpadl náročný sestřih
-  malé RNA vymizely nebo nahrazeny stabilnějšími proteiny
Í3.V t #W pro&Jmt-f íhi Of MU'j						
		rtu. rqlßir "«rip P.SA "li :* -jBiurna 4í-:'Mb!íi>'» <-T . ..-CA.			=ri7- =1  - >--    i:i_i rtT""r,lii*ir ^ptí^tv ■.-r-'j-.F^ r-D*lff  ■ -*£  »L-fll-L-l   j. u.lUH	
		^^ i				
				\y		
			f	Sk		
		1 tlp^A !>iK*Mr «*r<»ri-.imff»n-7| dupáním, iliLtdidiBl w--1		\		
		]		1		
		4 ŮaiEEf [MĚ		•		
						
						
Antrim tmiíi* m* a.\p «™hw						
						
						
		íi""Bp»M p>B ji> lita m wy^vr^ ttjUHfc HUM IjHťUHI				
						
						
~nr*-<ipjpt#iirBLi"		k   =>ri*.t   l[íl*4»   ÜVu ř, ale			tErfe-rckadj-ťtiťHdril   priMd*	
						
						
						
						
		1. CMt-akjřá- Chi M J   k1)				
						
ôenomy prokaryot jsou mladší a
odvozené
Derivation of the		Prokaryotes		
	Riborgis		Eukriry-	Prokary-
	eigensis	LUCA	otos	otes
DNA genome	—	+	+	+
Diploid or polyploid	+	+	+	—
Telornerase RNA	+	+	+	—
Li near Genome	+	+	+	—
rRNA processing by snoRMA	+	+	+	—
mRNA processing by snRNA3	+	+	+	—
tRN A processing by R Nase P	4-	+	+	+
Coupled rRNA transcription				
& processing	—	—	—	+
Coupled transcription				
& translation	—	—	—	+
Ge nome-en coded C CA ta ilE	—	—	—	+
				
ôenomy prokaryot jsou mladší a
odvozené
PŮVODNÍ6ENOM
-  lineární
- f ragmentovaný
-  introny obsahující
- RNA molekuly potřebné pro úpravy RNA
EUKARYOTA
ODVOZENY 6ENOM
- cirkulární
- jedna molekula
- operony obsahující
- mnohé RNA nahrazeny proteiny
PRO K A RY OTA
Mechanizmus přechodu LIN -►CIRK genomu na modelu retroviru:
- transkripce retroviru spolu s genem a přepsání do DNA a cirkularizace
- množství cirkulárních molekul s různými geny, jejich rekombinace a zvětšování
- selekční zvýhodnění cirkulárních molekul (termostabilita a rychlejší replikace)