Metody analýzy proteomu Dvourozměrná elektroforéza cytoplasmatických bílkovin Dvourozměrná elektroforéza (2D-PAGE) představuje základní nástroj v novém rozvíjejícím se směru proteomiky. Umožňuje rozdělení komplikovaných směsí stovek různých bílkovin. Je kombinací isoelektrické fokusace (IEF) a elektroforézy v polyakrylamidovém gelu (PAGE). Obě separace se provádějí postupně tak, že nejprve se provede isoelektrická fokusace na proužku gelu s imobilisovaným pH gradientem (IPG), kdy se bílkoviny rozdělí podle svých isoelektrických bodů (pI). Poté se připraví polyakrylamidový gel s přídavkem dodecylsulfátu sodného (SDS), na jehož startovní stranu se těsně přiloží proužek IPG a po zalití spojovacím gelem (obvykle agarosa) se provede elektroforesa ve směru kolmém na původní směr IEF. Bílkoviny se zde rozdělí podle svých M[r]. Po jejím ukončení se gel obarví na bílkoviny a získá se dvourozměrný obraz sestávající z více či méně dobře oddělených skvrn představujících jednotlivé bílkoviny. Spolu se vzorkem je možno ve 2. směru (SDS-PAGE) dělit standartní směs bílkovin o známých M[r] a okalibrovat gel tímto parametrem. Tak můžeme každou skvrnu charakterisovat podle její polohy jak jejím pI tak M[r]. Pozor! Všechny laboratorní kroky počínaje přípravou extrakční směsi provádíme v rukavicích. Předejdeme tím kontaminaci vzorku kreatinem, který může dávat falešné výsledky při barvení stříbrem a zcela nezbytné je toto opatření při manipulaci s monomery (akrylamidem) při přípravě gelu. 1. Kultivace mikroorganismu Studovaný mikroorganismus kultivujeme podle doporučeného postupu optimálního pro příslušný druh event. kmen či mutant. Sklizenou kulturu dobře promyjeme pomocí centrifugace a suspendování v odpovídajícím mediu. Pro účely elektroforézy je důležité nepřekročit tolerovanou hodnotu iontové síly, pro IEF v našem provedení je maximum odpovídající 40 mM TrisCl. V našem modelovém provedení použijeme jako vzorek buněk komerční preparát pekařského droždí Saccharomyces cerevisiae. Provedení: 10 g pasty pekařského droždí rozmícháme v malém množství vody a pak doplníme na 200 ml. Suspensi zcentrifigujeme 5 min. při 10 000 ot/min. a supernatant vyhodíme. Sediment suspendujeme v 10 ml vody a změříme objem suspense. Odhadneme objem sedimentu (rozdíl objem suspense – 10 ml). Pak doplníme do ca 200 ml a znovu centrifugujeme. Toto promytí provedeme celkem 4krát (alespoň poslední 2 promytí s destilovanou vodou). Poslední suspensi doplníme vodou tak, že 1 ml sedimentu bude odpovídat 10 ml. Centrifugaci pak provedeme v menších kyvetách s 10 ml suspense v každé. Supernatnty vyhodíme, sedimenty zpracujeme nebo uskladníme při –20 ^oC. 2. Extrakce bílkovin a předúprava vzorku Standardní metoda reprodukovatelně solubilisuje všechny typy bílkovin včetně hydrofobních. Zabraňuje agregaci a změnám rozpustnosti během dělení a modifikacím bílkovin při dalších operacích. Interferující sloučeniny, zvl. DNA, jsou při ní odstraněny. V případě potřeby se doplňuje částečnou frakcionací, pokud je sledovaná bílkovina velmi málo zastoupena, odstraní se nadbytek interferujících majoritních bílkovin. Toho je dosaženo působením směsi detergentů, chaotropních látek, reduktantů, pufrů a amfolytů. Jejich vhodnou kombinaci představují komerční extrakční směsi, ve cvičení si je připravíme smícháním individuálních komponent dle tabulky. Stejná směs se používá i pro rehydrataci IPG proužků pro IEF. Připravíme si tedy jen nezbytné množství, roztok je možno omezeně skladovat při –20 ^oC. Provedení: Připravíme si extrakční směs podle tabulky. Obsahuje močovinu, redukční agens dithiothreitol (DTT) nebo tributylfosfin (TBP), detergent 3-[(3-Cholamidopropyl)dimetylammonio]-1-propansulfonát (CHAPS), stabilizační amfolyt a bromfenolovou modř ke sledování migrace vzorku při elektroforéze. DTT nebo TBP se přidává bezprostředně před užitím. Případné nadbytečné množství lze rozdělit na alikvotní podíly a zmrazit, rozmrazujeme pouze jedenkrát, nadbytek již nezmrezujeme, ale vyhodíme. Je-li nutno pufrovat pH, lze přidat Tris v koncentraci 10-40 mM. Je nezbytné udržovat nízkou iontovou sílu roztoku, jinak může proud při IEF překročit stanovený limit. +--------------------------------------------------------------------------------------------+ | Komponenta | Množství | |------------------------+-------------------------------------------------------------------| | 8 M močovina | 25 g močoviny rozp. v 25 ml vody, nebo 47 ml 8,5 M zásobního | | | roztoku (510 g/l) | |------------------------+-------------------------------------------------------------------| |50 mM DTT nebo 2 mM TBP | 385 mg DTT nebo 500 ml 200 mM zásobního roztokuTBP | |------------------------+-------------------------------------------------------------------| | 4% CHAPS | 2 g | |------------------------+-------------------------------------------------------------------| | 0,2% amfolyt^a | 125 ml 40% nebo 250 ml 20% | |------------------------+-------------------------------------------------------------------| |2 ppm bromfenolové modři| 100 ml 0,1% zásobního roztoku | |------------------------+-------------------------------------------------------------------| | Voda | do 50 ml | +--------------------------------------------------------------------------------------------+ ^a Výběr amfolytu odpovídá rozmezí pH gradientu při IEF. Je dodáván jako roztok ve 40% event. 20% koncentraci Buňky získané ad 1 extrahujeme v poměru 1 ml sedimentu s nejméně 9 ml extrakční směsi (konc. močoviny je nejméně 6,5 M). Extrakci provádíme v centrifugační kyvetě odpovídající velikosti za laboratorní teploty. Suspensi buněčného sedimentu v extrakční směsi promícháváme skleněnou tyčinkou a roztíráme po dobu ca 5 min. Pak ji centrifugujeme až dostaneme čirý supernatant a pevný sediment (obvykle stačí 8 min. při 12 000 g). Sediment je možno opakovaně extrahovat nebo vyhodit. Supernatant zpracováváme dále, je výhodné jeho větší množství rozdělit na alikvoty a uchovávat při –20 ^oC. Ve vzorku stanovíme koncentraci bílkovin některou z běžných metod (viz základní cvičení z biochemie) s přihlédnutím k omezením plynoucím z přítomnosti detergentu. Modifikace extrakčního postupu: Solubilisační roztoky pro dokonalejší extrakci lze doplnit dalšími chaotropními látkami (2M thiomočovina)a detergenty nebo použít postupnou extrakci různými extrakčními roztoky. To umožní extrahovat též hydrofobní membránové bílkoviny. 1. Isoelektrická fokusace – 1. směr IEF provádíme na komerčních proužcích s imobilizovaným pH gradientem (IPG). Je možno zvolit některé z nabízených rozmezí a formy gradientů i délku IPG proužku. Ta určuje množství bílkoviny ve vzorku a jeho objem, který aplikujeme pro tento krok – pro 17 cm je to 100–300 mg bílkovin a 300 ml, pro 11 cm 50-200 mg a 185 ml a pro 7 cm 10-100 mg a 125 ml. Dodané proužky je nutno rehydratovat – to se provádí extraktem (obsahuje jak původní směs tak vyextrahované bílkoviny), takže se současně vnáší na gel vzorek. Provedení: Napipetujte 125 ml supernatantu do rehydrataení vanieky. Odstraote ochrannou folii z IPG proužku pH 3-10NL a položte ho opatrně pomocí pinsety gelem dolu na vrstvieku kapaliny tak, aby celý povrch byl dobře smoeen. Nechejte stát po dobu 1 hod. a pak proužek opatrně převrstvěte minerálním olejem a nechejte v chladniece botnat přes noc. Pinsetou umístíme na elektrody aparátu pro IEF tamponky z buničité vaty ovlhčené 5-8 ml vody. Nabotnalý IPG proužek položíme do dráhy gelem dolu tak, aby jeho konce spočívaly na tamponech s odpovídající orientací - tj. konec 3 na katodě a konec 10 na anodě. Převrstvíme opatrně minerálním olejem tak, aby proužky byly zaplaveny. Na aparátu nastavíme požadované parametry (pod dohledem vedoucího), obvykle 50 mA na proužek, maximum 4000 V, celkovou hodnotu 7-10000 V.hod a zvolíme program (obvykle rychlý zpusob). Po ukončení běhu proužky mužeme skladovat v rehydratačních vaničkách při -20 ^oC i níže nebo je okamžitě podrobíme SDS-PAGE. 2. SDS – PAGE – 2. směr Toto dělení provádíme na gelech o rozměru odpovídajícím délce IPG proužku, k tomu nutno připočíst místo pro standarty bílkovin. Nejprve si připravíme směs pro dělicí gel a během její polymerace upravíme IPG proužky z 1. dělení. Ty pak vložíme na horní část gelu, vedle umístíme tampon se standarty a necháme proběhnout dělení. Provedení: Příprava dělicího gelu. Přichystáme (zkontrolujeme příp. hotové) zásobní roztoky 3. monomery - roztok A – 87,6 g akrylamidu a 2,4 g BIS (N,N^’-metylen-bisakrylamidu) v 300 ml vody 4. roztok B – 1,5 M TrisCl o pH 8,8 5. roztok D – 10% SDS (dodecylsulfát sodný) a připravíme zcela čerstvý roztok persíranu amonného (150 mg/ml). Ve stojánku sestavíme formu pro 7 cm gel ze dvou skel a 1 mm distančních proužků, zafixujeme šrouby a zaklapnutím upevníme. Naplněním vodou zkontrolujeme, že sestava je těsná, vodu pak vylejeme a zbylé kapky odsajeme proužkem filtračního papíru. Čerstvě připravené roztoky A a B i vodu odvzdušníme (ultrazvukem nebo v odsávače). Připravíme roztok pro 12% gel smícháním 6 ml A, 3,75 ml B, 5,05 ml vody, 0,1 ml D, 0,1 ml persíranu a 10 ml TEMED (tetrametyletylendiaminu). Směs opatrně promícháme, abychom předešli zavzdušnění a naplníme jí formu pomocí injekční stříkačky. Nahoře ponecháme asi 1 cm místa pro vložení IPG proužku a převrstvíme isobutanolem. Necháme polymerovat asi 1 hod. i více a mezitím si upravíme IPG proužek po IEF. Úprava IPG. Bílkovinné frakce získané IEF se upraví tak, aby získaly uniformní tvar a náboj. Toho se dosáhne působením redukcí disulfidických můstků pomocí dithiotreitolu (DTT), alkylací vzniklých –SH skupin jodacetamidem (IAA), rozrušením vodíkových vazeb močovinou a navázáním silného aniontogenního detergentu SDS (dodecylsulfát sodný). Nejprve si připravíme (není-li již hotov) základní pufr o složení 50 mM TrisCl o pH 8,8, 6 M močovina, 2% SDS a 20% glycerol. Ve 2,5 ml tohoto pufru rozpustíme 50 mg DTT (2%) na nalejeme ho na IPG proužek umístěný ve vaničce. Necháme působit 10 min. za mírného pohybu kapliny (na třepačce nebo ručně). Mezitím rozpustíme v dalších 2,5 ml základního pufru 65 mg IAA (2,5%) a až ukončíme působení 1. pufru zdekantujeme ho a nalejeme na IPG proužek 2. pufr a opět necháme alespoň 10 min. inkubovat. Mezitím si připravíme vzorek standartních bílkovin tak, že odstřihneme asi 5 mm z proužku savého tamponu (Protean IEF), vneseme 10 ml roztoku standartů a necháme vsáknout. Připravíme si asi 10 ml 1% roztoku agarosy v pracovním pufru pro SDS-PAGE – viz níže. Je-li již připraven v chladničce, zahřátím na vodní lázni agarosu rozpustíme. Slijeme z polymerovaného gelu (PAG) krycí vrstvu isopropanolu a zbytky odsajeme. Inkubovaný IPG proužek vyjmeme z vaničky a vložíme na připravený PAG. Zatlačíme ho špachtlí do těsného kontaktu s gelem bez bublin, vedle něj zasuneme proužek se standarty a zalejeme teplým roztokem agarosy. Elektroforetické dělení. Připravíte si pracovní elektrodový pufr zředěním 60 ml zásobního roztoku (15 g Tris, 72 g glycinu a 3 g SDS v 1 litru, upraveno HCl na pH 8,3) 240 ml destilované vody. Po zatuhnutí agarosy se desky vloží do aparátu Protean II a jeho nádobky se naplní pracovním elektrodovým pufrem. Do horní nádobky kápneme několik kapek 0,05% bromfenolové modři, aby byl pufr slabě modře zbarven. Připojíme zdroj, zapneme a nastavíme napětí na 150 V. Dělení trvá asi 4 hodiny, jeho postup sledujeme podle modré linie bromfenolové modři. Až doputuje na konec gelu, odpojíme zdroj, vyjmeme desky a opláchneme vodou. 6. Barvení a snímání obrazu Provádí se několika způsoby lišících se citlivostí, náročností na chemikálie a provedení apod. Jednoduché a spolehlivé barvení spočívá v adsorpci barviva (Coomasie Blue), jež se dá vymýt z gelu, na bílkovinách je však poutáno pevněji (přehnaným odbarvováním se však vymyje i z nich!) Provedení: Demontujeme rámeček s gelem, odstraníme krycí sklo a gel opatrně přeneseme do misky s fixačním roztokem (30% isopropanol, 10% kys. octová). Po 2 hod. roztok slijeme a nahradíme barvicím roztokem (0,04% Coomasie Blue R-250 v 25% isopropanolu a 10% kys. octové). Necháme působit alespoň 6 hod. za mírného pohybu (na třepačce), pak slejeme a gel odbarvujeme 40% metanolem s 10% kys. octovou, který vyměňujeme po 30 min. až 2 hod. (zprvu častěji) až je pozadí gelu téměř bezbarvé. Hotový gel se oskenuje (provede obsluha vyhodnocovacího zařízení), obrázek se vytiskne a přiloží k protokolu. Podrobnější vyhodnocování se provádí pomocí počitače vybaveného patřičným softwarem, jednotlivé skvrny proteinů se dají vyříznout a dále analysovat pomocí hmotnostní spektroskopie. To však vyžaduje dokonale zvládnutou techniku dělení a reprodukovatelné výsledky ve formě prakticky identických snímku 2D-SDS-PAGE. Toho lze dosáhnout pouze mnohonásobným opakováním základní dělicí techniky.