Nukleární magnetická rezonance Sumární spin subatomárních částic (p,n,e) 0, 1/2, 1,3/2,2... Celkový spin I ^> 21 + 1 orientací Počet jader v jednotlivých orientacích (dojde k rozštěpení v magnetickém poli) n /N = exp (-AE/kT) Energy levels for a nucleus with spin quantum number 1/2 oj QÍ 0 - LU m f ,j Applied Notield magnetic field .7) = - -r ,TÍ = ♦* U NMR = 0,99998 Nukleární magnetická rezonance Magnetický moment rotujícího jádra ji ji = ylh/27i y gyromagnetický poměr Applied magnetic field + Precessional , orbit Spinning nucleus Umístění rotujícího magnetu v elektrickém poli Frekvence rotace: v0 = y Bo Bo- indukce mg. pole Nukleární magnetická rezonance Rozdíl mezi dvěma energetickými hladinami AE = yhB0 = hv0 pokud působíme elm. polem o frekvenci v^Vq Dojde k rezonanci a přechodu na vyšší Hladinu v0 = yBo Nukleární magnetická rezonance (B = 2,3 T) Jádro I vo (MHz) citlivost % zastoupení 1H Ví 100 1 99,9 13C Ví 25 0,016 1 15N 1 10 0,001 0,36 19F Ví 94 0,8 100 31P Ví 40 0,067 100 170 5/2 13 0,003 0,04 Nukleární magnetická rezonance Spin-mřížková relaxace Jádro v excitovaném stavu se zbavuje energie relaxací Relaxační čas (střední doba života jader v excitovaném stavu) - T = 10-1- -102S M7 M ,¥,Z /--NUl-e') T- t Nukleární magnetická rezonance Stínění jádra - chemické posuny B ZS Magnetic field produced by circulating electron © ° H H+ B - B0 - oB0 T= 10-G T chemický posun (ppm) Nukleární magnetická rezonance Chemické posuny CH3 1 CH2 1,5 R2NH 0,5-2 RNH2 1,5 ArCH3 2,5 -C5CH 3 Ar-NH2 3,5-4,5 X-CH3 2,5-3,5 R-0-CH3 4 =C=CH2 5 ArH 7-8 RCOH 10 RCOOH 10-12 Nukleární magnetická rezonance Multiplicita signálu - spin-spinová interakce App ied field Spin oriertations of methylene protons Msthylene I CH3-CH2—OH Me hyl -*— —► 4-------- -------► 4-------- -------► -------► Multiplicita = n+1 (x+ 1)n Methyl triplet Methylene quartet 1 9876543210 Nukleární magnetická rezonance Applied field Spin orientations of methyl protDns ■*---------------- < ----------------*■ - 4--------------- ■*--------------- - 4-------------- -------------*■ ■* 4---------- -4--------- - ---------► ■4--------- -4 Methyl triplet Methylene quartet 9876543210 Nukleární magnetická rezonance Přístrojové vybavení B1 VF SHIM POWER SUPPLV PRINTER, GRADIENT AMP GRADIENT PULSE PR0G i RF DETECTOR i DIGITIZER COMPUTER PULSE PROG - RFAMP RF SOURSE Nukleární magnetická rezonance Vacuum Liquid Helium Liquid Nitrogen Container & Support Superconducting Coil Supravodivý magnet 7 T Nukleární magnetická rezonance Vzorek - homogenizace pole Nukleární magnetická rezonance Volba přístroje 400 MHz t—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—r 5 2.1 2.0 1.9 t—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—r Av 80 40 0 100 MHz i ■ i ■ i ■ i ■ i ■ i ■ i ■ i ■ i ■ i ■ i ■ i ■ i 5 2.1 2.0 1.9 t—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—i—■—r Av 20 io o Atomy: 1,89 2,00 2,08 Nukleární magnetická rezonance Metoda continuous wave (CW) - konstantní frekvence - mění se Bo Q) 'cö N LL > 0 D) <Ď C LU 0 Ü Q. O C/) .Q < Magnetické pole Magnetické pole Nukleární magnetická rezonance Metoda continuous wave (CW) - konstantní Bo - mění se frekvence Q) 'cö N LL > 0 D) 0 C LU 0 Ü Q. O C/) .Q < Frekvence Nukleární magnetická rezonance Fourrierova transformace Time RF 90* Signal Frequency Nukleární magnetická rezonance Rozpouštědla - Deuterovaná Acetone CD3COCD3 Chloroform CDCI3 Methyl n itrile CD3CN Water D20 Diethylether (DEE) (CD3CD2)20 Dimethyl Sulfoxide (DMSO) CD3SOCD3 Ethanol CD3CD2OD Atd. Signal-to noise ratio Nízká a vysoká koncentrace Poor SNR 5. ' I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I o 0 Exchange ~ ■ 1 ■ 1 ■ 1 ■ 1 ■ 1 ■ 1 ■ 1 ■ 1 ■ 1 ■ 1 ■ 1 0 0 Nukleární magnetická rezonance Chemické posuny CH3 1 CH2 1,5 R2NH 0,5-2 RNH2 1,5 ArCH3 2,5 -C5CH 3 Ar-NH2 3,5-4,5 X-CH3 2,5-3,5 R-0-CH3 4 =C=CH2 5 ArH 7-8 RCOH 10 RCOOH 10-12 Nukleární magnetická rezonance Toluene - CDCI3 Ethyl benzene - CDCI3 T" 10 T 4 I ' I 1 0 Acetone - CDCI3 Sj ' I ' I ' I ' I ' I ' I O 10 9 8 7 6 5 1-propanol - CDCI3 T 4 CH3 OH Sj ' I ' I ' I ' I ' I ' I ' I ' I ' I ' I ' I P 5 4 3 2 1 0 I ' I T 4 I ' I ' I Nukleární magnetická rezonance MEK - CDCI3 CH, CH, CH, 1 ■ 1 T 4 I ' I ' I 3 I ' I 2 I ' I 2-propanol - CDCI3 CH jL OH CH, 1 ■ 1 T" 4 I ' I ' I 3 I ' I 0 t-bu1anol - CDCI3 OH CH, s ■ 1 ' 1 o 5 T 4 I ' I ' I 3 I ' I I ' I 0 2-butanol - CDCI3 Nukleární magnetická rezonance Spin-decoupling -.....____LILU CH(CH2CH3)3 s- ' I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I ■ I o -? 1 n Decoupling přes -CH2- i ■ i ■ i ■ i ■ i ■ i ■ i ■ i ■ i ■ i ■ i Decoupling přes -CH- Sj ' I ' I ' I ' I ' I ' I ' I ' I ' I ' I ' I O 2 1 0 Nukleární magnetická rezonance- 13C Carbon-13Chemical Shifts Carbon-13* Environment Chemical Shift Range (ppm) CH3CH2 0-50 -C5C-= 60-100 =C-X 70-170 C.H. 65 CHCI CHCI (cis) 71 Ar 120-150 CCI. 97 COOR 170 COH 210 RCOR 220 Nukleární magnetická rezonance- 13C Spin-spinová interakce mezi 13C-1H Spektrum CH3I ô Nukleární magnetická rezonance- 13C Spin-spinová interakce mezi 13C-1H Spektrum CH3I Interakce C-3H ô Decoupling přes H ô Nukleární magnetická rezonance-15N Nitrogen-14 Chemical Shifts Nitrogen-14* Environment Chemical Shift Range (ppm) N02Na -355 NO 3- (aqueous) -115 N2 (liquid) -101 pyridine -93 bare nucleus 0 CH3CN 25 CH 3CONH2 (aqueous) 152 NH.+ (aqueous) 245 N H, (liquid) 266 Nukleární magnetická rezonance- 31P Phosphorous-31 Chemical Shifts Phosphorous-31 Environment Chemical Shift Range (ppm) PBr. -228 (C.H.O). P -137 PF. -97 85% phosphoric acid 0 PCI. 80 PH. 238 P. 450 Nukleární magnetická rezonance- 31P FIG. 1. Phosphocreatine synthesis by isolated rat skeletal muscle mitochondria followed by 3 IP NMR spectroscopy: two series of typical spectra obtained during one hour with mitochondria (a) in the presence of I mM ATP or (b) in the presence of 1 mM ATP and 7 nmole/mg proteins of atractyloside. Peak assignments are (1) Pi, (2) PCr, (3),~(4), and (5) y-, a-, ß- phosphorus of ATP respectively. Nukleární magnetická rezonance- 31P •20 5 w-ysr v^ corn 'fo COB roo: TIP ■30 PPM Fig. 12. l|P-NMR spectra of living plant tissues, under oxygenated conditions. Peak assignments: I. Gle-6-P; 2, cytoplasmic P,; 3. vacuolar P,; 4, yATP; 5. aATP; 6, UDPG and nicotinamide adenine nucleotides; 7. /3ATP. [From Roberts (1984), with permission.) 1 ' ' ' i ■ ■ ' ' 1 ' ' ' ' I ' ' ' -25 -30 -35 PPM .Figjjy ^F-NMR partial spectra of the nucleotide region of (a) hypoxic maize root tips; (b) irmoTic maize root tips; (c) extract of normoxic maize root lips, to which commercial ADP has been added; (d) extract of normoxic maize root lips, prior to addition of ADP. Peak assignments as in Pig. 12, except peak 4A. 0ADI» (peak S will include a conlrihution from «ADP. in addition to «ATP). [From Roberts <•/ at, (19K5b). with permission.| Nukleární magnetická rezonance- 31P Měření intracelulárního pH Pomocí posunu signálu 31P NDP hexoses ppm 5 -10 -15 -20 Fig. .8. In vivo 3IP NMR spectra of BHK2I cells (acquisition dme of 3. min): (A) control conditions; (B) cells incubated with 60 mM lactate; (C) cells incubated with 10 mM ammonia. Assignments: PME, phosphomo-noesters; Pj (int.), intracellular inorganic phosphate; NTP-nucleoside triphosphates, NDP-nucleoside diphosphates. Nukleární magnetická rezonance- 31P Měření koncentrace nukleotidů Pomocí 31P Figure 3 Typical 31P NMR spectra from an isolated rat heart perfused with glucose only (right) or glucose and pyruvate (left). The major resonances, from left to right, report the relative heart contents of inorganic phosphate (Pi), PCr and the three phosphates of ATP (y, a and ß). Note the increase in PCr resonance area and fall in Pi resonance area when pyruvate is added to the glucose-containing buffer. Nukleární magnetická rezonance- 31P Měření koncentrace nukleotidů Pomocí 31P A D —i—i—i—t—i—i—i—i—■—i k^ml^S^^^ B in 60mM K+ V"^VťViM/iYVA^ in 60mM K+ A^wH^v*^ IAA-iodacetát recovery (Ihr) in normal K+ 'v^'VvV^A^A^^Vi^jA recovery (Ihr) in normal K+ Uv%,^vy^/y^^ 0 -10 Chemical shift (ppm) 10 0 -10 Chemical shifi (ppm) •20 3Ir Fig. 1. - P NMR spectra of well-oxygenated rat brain slices pretreated with IAA and FC (IAA-pretreated neuron-rich slices) in ACSF containing lactate at 25 *C. A-C: 3 'P NMR spectra from intact slices; A, under resting condition in normal K+ ACSF; B, during high-K+ stimulation for 8 min; C, after 60 min in normal K+ ACSF. D-F: those from ischemic preconditioned slices, each corresponding to the conditions in A-C: respectively. Each spectrum represents an accumulation of 256 FlDs. Line broadening is 10 Hz. SP, sugar phosphates; Pi, inorganic phosphates; 7-. ut-, and [i-, 3 peaks of ATP. Nukleární magnetická rezonance- 13C 30 20 ppm 130 120 110 100 90 80 70 60 50 Fig. 7. Representative I3C NMR spectrum acquired from a perfused rat heart under preischemic conditions after 30 min of labeled perfusion. The abbreviations denote [t-13C]gIycogen (G), the a- and ß-anomers of [i-13C]glucose (a and ß), and [2-13C]ribose (R) used as standard. ■? s? PC Lschemia Re perfusion 120 - -«— PC) 100 - tŕ ~^*~~ 1 80- 60 - 40 - 20 - IV p^šT 0 - JJ «ŕ-*-*-^-A-A I \~ I 1 1 -60 -50 -40 -30 -20-10 0 10 20 30 40 50 60 70 Time (jniautes) Fig. 8. ,3C-Labeling and mobilization of [l-I3C]glycogen during protocol set I in preconditioned hearts (PCI, n = 6, O) and ischemic controls (I, n-6, a). The labeled perfusion started at ' = —50 min for the preconditioned hearts and f =—42 min for the controls. During the first 30 min of perfusion (stabilization), the behavior of the two groups was almost identical. [1-'3C]-Glycogen was partially reduced by the first cycle of preconditioning ischemia and was not further reduced by subsequent cycles. In the PCI group, preischemic glycogen proved lo be lower than that in Group I, with reduced [i-l3C]glycogen mobilization during early ischemia (/ = 0-I5 min). Only the PCI group resumed glycogen synthesis. Mean ±S.E.M. Nukleární magnetická rezonance- 15N Asimilace amoniaku sledovaná Pomocí 15N t—r PS ,- M ^ O ■s NAG ■ŕ* i m v+t***-*** /■ T-Gl n Arg *"NHJ I I I------h ^^^^ 200 180 160 K0 120 100 80 60 £0 20 0 ppm Fig. 1. ĽN-NMR spectrum (ppm) of cell-free extract from the mycelium of P. ostreatus. Top: mycelium grown in 15NILtCI, bottom: mycelium 1 h after the addition of ^Nt^Cl. EPR - elektronová B=0 spinová rezonance Nepárový elektron Ms = +1/2 Ms = -1/2 Rezonanční pole EPR - elektronová spinová rezonance AE = hv = gjiBo Počet jader v jednotlivých orientacích AE rozdíl energií h is Planck constant v is frekvence mikrovln N1/N2 = exp(-AE/kT) EPR = 0,989 g faktor spin-orbitální interakce B magnetické pole Bo = 0,1 -0.5T; v = 10-100 GHz EPR - elektronová Bo spinova rezonance dl/dB EPR - elektronová spinová rezonance Interakce s protony 1 proton I = 1/4 multiplicita = n + 1, intenzita píku (x + 1)n 1:2:1 1:3:3:1 EPR - elektronová spinová rezonance Využití v biochemii -Studium radikálů (peroxidy) -Studium konformace - spinové značky - studium hernu ^-^^/COOH EPR - elektronová spinová rezonance OH CH, Ol * Unknown secondary radical anion. "CH3 Primary radical anion ESR Spectrum ŕ 4 5 Gauss ¥ EPR - elektronová spinová rezonance EPR spektrum NADH-UQ reduktasy signál UQ Signál 2Fe2S potlačen, Signál FMN radikálu interferuje B > 1 eg -200 3225 3250 3275 3300 Magnetic field, G 3225 3250 3275 3300 Magnetic field, G Fig. 1. EPR spectra of the radical signals in Na'-NQR from V. hwveyi. (A) Air-oxidized, (B) ditliionite-reduced. Sample conditions; 50 mM Hepes/Tris (pH 7.5), 200 mM NaCl and 0.05% DM, protein concentration 3 mg ml ', (B) dithionite, 5 mM. EPR conditions: microwave frequency, 9.15 GHz; microwave power, 100 uW; temperature, —40 "C; modu[alion amplitude, 0.2 ml EPR - elektronová spinová rezonance EPR spektrum ferredoxinu z mořské řasy (3Fe-4S)1+/0 Typický signál MM. Pereira et al. / Btochimíca et Biophysica Acta 1601 (2002) IS ■ A ! - \ ^\. ^^^^ • — 320 330 340 350 Magnetic Field (mT) 360 380 Fig. 2. (A) UV-visible spectrum of the oxidised ferredoxin from R. marinus. (B) EPR spectra of the ferredoxin from R. marinus in oxidised form and perpendicular mode {main spectrum) and reduced form and parallel mode (insertion). EPR conditions—temperature: 10 K; microwave frequency: 9.64 GHz (perpendicular mode) and 9.43 GHz (parallel mode); nücröwave power: 2.4 mW; modulation amplitude: 0.9 mT. Protein concentration 50 uM (A) and 100 jiM(B). EPR - elektronová spinová rezonance EPR spektrum cyt bei - mutant M183K, M183H Fe3+ hem (3,78 = cyt bL 3,44, cyt bH, 2,94 bis-His cyt b nebo d) J: Li et, al. / Biovhimica et ßiopl 3.44 3.78 180 200 22D Magnetic Field, mT 240 Fig. 2. X-band EPR spectra oíltb. capsulatus cytochromes. (A) Cytochrome bc\ complex containing MI83K cytochrome c, (39 u.M). (B) Purified MI83K cytochrome tt (I48 jaM). (C) Cytochrome bc\ complex containing M183H cytochrome c, (29 u.M). (D) Purified M183H cytochrome c, (24 u.M). The buffer conditions are: lOOmMTris-DCl (p£> = 8.0), lOmMNaCl, 0.1% dodecyl maUoside and 55%