Úloha do pokročilého cvičení z analytické chemie - JS 2007/2008
Vedoucí cvičení ing. Blanka Hégrová
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie - vstup pro syntézu
oligonukleotidů, kontrola čistoty
CÍL ÚLOHY - ověřit si při řešení praktického úkolu vlastnosti kapalinové chromatografie.
Podmínky:
základní znalosti teorie HPLC (písemný test)
znalost úlohy (písemný test)
laboratorní plášť, přezůvky
oběd pouze jeden po druhém ;-)
Formulace řešeného analytického problému
Syntéza oligonukleotidů je dnes běžnou součástí praxe molekulární biologie. K tomuto slouží
jednoúčelová zařízení, syntezátory, které z výchozích látek, zde nukleotidů, syntetizují požadované
řetězce.
Základním požadavkem pro kvalitní syntézu je čistý vstup. Jakékoliv příměsi, schopné
reagovat podobně, mohou způsobit snížení výtěžku. Proto je důležité mít možnost dopředu zjistit
kvalitu vstupů. Vzhledem k chemické povaze nežádoucích příměsí, jedná se o izomery, je jedinou
možností separace pomocí HPLC:
vhodný vstup: obsah izomerů < 3 %
nevhodný vstup: obsah izomerů > 3 %
Formulace úkolu
Pomocí HPLC stanovení procentuálního obsahu příměsi (nečistoty) ve vzorku guanosin 5'-
monofosfátu.
Vzorky
Standardy bází nukleotidů: guanosin-5'-monofosfát (5-GMP),
guanosin-2'-monofosfát (2-GMP),
guanosin-3'-monofosfát (3-GMP).
Knihovna UV-VIS spekter purinů, pyrimidinů, nukleosidů a nukleotidů.
Vzorek guanosin-5'-monofosfátu
Mobilní fáze: 25 mM fosfátový pufr, pH 7.0
Přístroje a zařízení
HPLC systém 10 AVP fy SHIMADZU (odplyňovač GT-154, systémová řídící jednotka SCL10AVP,
2x pumpa LC-10AVP, pícka CTO-10ASVP, PDA detektor SPD-M10AVP, řídící software
Class-VP 5.02), kolona 2x100x4.6 mm, Onyx C18, monolitická, velikost pórů: 13 nm mezopóry, 2 m
makropóry.
PRACOVNÍ POSTUP
Analýza vzorku 5-GMP
1. Chromatografická analýza roztoku vzorku vstupu 5-GMP.
Analýzy standardů
1. Chromatografická analýza standardního roztoku 5-GMP
2. Chromatografická analýza standardního roztoku 2-GMP
3. Chromatografická analýza standardního roztoku 3-GMP
Identifikace složek, kvantifikace a stanovení rozsahu metylace
1. Identifikace jednotlivých složek vzorku pomocí retenčních časů standardů a pomocí
knihovny UV-Vis spekter.
2. Vybranou kvalifikační metodou stanovit procentuální obsah nečistoty.
3. Na základě takto získaných údajů určit vhodnost vstupu pro syntézu.
4. Komentář k výsledku pro řešení analytického problému.