Molecular Ecology Co je molekulární ekologie? Uměle vytvořený obor vymezený technickým přístupem. Na ekologické problémy hledá odpověď pomocí molekulárních metod. (Zoologové a botanici nakoupili cyklery a sekvenátory, snažili se je využít i k něčemu jinému než je taxonomie => vznikla molekulární ekologie) Pracuje na různých úrovních variability DNA (genom, jedinec, populace, skupina populací) Je to vlastně aplikovaná populační genetika Proč používat molekulární metody v ekologii? • Často nelze jinak • paternita – páření často skryté a nemusí vést k oplození • identifikace z trusu, chlupů - pohyb jedinců skrytě žijících druhů • izolace populací – nemusí být zřejmá • počet migrantů – nelze sledovat naráz všechny jedince Její význam vzrůstá ... • Je překvapivě kompaktní • Je populární - Molecular Ecology (od 1992) – dnes 24 čísel za rok • ISI Journal Citation Reports® Ranking - 2006: 6/116 in Ecology; 5/35 in Evolutionary Biology; 47/263 in Biochemistry & Molecular Biology; Impact Factor: 5.169 • Vyšly i její učebnice • Na řešení velmi odlišných problémů používá obdobné metody • Snad se dá tedy i přednášet ... Vychází z populační genetiky • Slavní zakladatelé moderní syntézy, třicátá léta • Matematické modely spojující genetiku a evoluční teorii Obsah přednášky • Příbuznost (neutrální znaky) – identita (stopy stejného jedince, klony) – paternita, vzdálenější příbuzní – vztah populací (izolovanost, výměna migrantů) – fylogeografie (historie šíření) – hybridizace, hybridní zóny • Geny pod selekcí – MHC, MUP, ABP, reprodukční proteiny – geny pro zbarvení • Ochranářská genetika Technické výlety (omezeně) Organismy ü Diploidní s pohlavním rozmnožováním ü Většinou obratlovci ü Budou ale i třeba motýli nebo slávky ü Rostliny fungují často jinak! Ale určitě i o nich bude řeč. Příbuzné přednášky, tj. co se zde objeví jen okrajově? • M. Macholán, J. Bryja - Genetické metody v zoologii • M. Macholán - Evoluční biologie • J. Zukal – Behaviorální ekologie • S. Pekár – Ekologie populací • aj. (molekulární ekologie „prorůstá všude“) Kolokvium • Zpracování review a prezentace na určité téma • Proč (problém) – Jak (metody) – Příklad • Např. Analýzy paternity: EPC – mikrosatelity (CERVUS) – posun v náhledu na párovací systém u pěvců Úrovně variability DNA • druh – fylogenetické analýzy (fylogenetická systematika, identifikace druhů – „barcoding“) Úrovně variability DNA • populace – studium speciace, fylogeografie Úrovně variability DNA • populace – populační biologie, ochranářská genetika) Úrovně variability DNA • jedinec – analýzy příbuznosti (behaviorální ekologie, např. analýzy paternity) Genotypizace – analýza genotypu • stanovení formy určitého úseku DNA (alely, haplotypu) • izolace celkové DNA z tkání • amplifikace požadovaného úseku DNA (PCR) • studium variability daného úseku (lokus) Izolace DNA • rozmanitý biologický materiál – musí obsahovat buněčná jádra nebo mitochondrie s nedegradovanou DNA • dnes většinou komerční kity • velký vliv fixace vzorků Fixace materiálu • čerstvá tkáň • čistý EtOH • rychlé vysušení • speciální extrakční pufry • zamražení • formaldehyd • opakované zamražování • rozvlhčování sušeného materiálu • další fixační média Genetické markery • Kódující DNA (geny) • Přepisované sekvence • Genetický kód • Ovlivňují fenotyp • Podléhají přírodnímu výběru • Narůstající význam v molekulární ekologii • Nekódující DNA • Nefunkční (neznámá funkce) • Neutrální k přírodnímu výběru – větší variabilita • Většina DNA u eukaryot • Pseudogeny • Repetitivní DNA Nejčastěji používané genetické markery PCR • Z celkové DNA si namnožíme jen úsek, který nás zajímá. • Co se bude množit? To určí primery. • Primery – krátké oligonukleotidy komplementární k úsekům ohraničujícím místo našeho zájmu. PCR „Molekulárně-genetické“ metody • analýza polymorfismu DNA • konzervativní vs. variabilní úseky (« loci ») • délkový polymorfismus (princip mikrosatelitů) Mikrosatelity • VNTR („variable number of tandem repetitions“), SSR („simple sequence repeats“) • jednotlivé alely se liší délkou „Molekulárně-genetické“ metody • analýza polymorfismu DNA • konzervativní vs. variabilní úseky (« loci ») • sekvenční polymorfismus (princip SNPs): Studium variability nasyntetizovaného úseku • délkový polymorfismus • elektroforéza Rozdělení fragmentů DNA podle velikosti • Agarosa - Hrubé rozdělení (do rozdílu 15 bp) • Polyakrylamid – Přesnější rozdělení (4 bp) • Sekvenátor, fragmentační analýza – nejpřesnější (fluorescenčně značené PCR fragmenty, např. značené primery) Studium variability nasyntetizovaného úseku • sekvenční polymorfismus • sekvencování • SNP („single nucleotide polymorphism“) analýza – např. RFLP, SSCP aj. Typ získaných dat formát GenAlex Obsah přednášky • Příbuznost (neutrální znaky) – identita (stopy stejného jedince, klony) – paternita, vzdálenější příbuzní – vztah populací (izolovanost, výměna migrantů) – fylogeografie (historie šíření) – hybridizace, hybridní zóny • Geny pod selekcí – MHC, MUP, ABP, reprodukční proteiny – geny pro zbarvení • Ochranářská genetika