Molekulární identifikace Druh, jedinec, pohlaví Definice druhu • Koncept biologického druhu – RIM = post- nebo prezygotické bariéry toku genů (ne vždy tak jednoduché – hybridní zóny, alopatrická speciace atd.) • Ochranářská biologie – je nutno rozhodnout o taxonomické jednotce (druhu), která vyžaduje pozornost • Forenzní genetika, vývojová stadia bez determinačních znaků, identifikace kořisti v trávicím traktu predátorů BARCODING LIFE, ILLUSTRATED Goals, Rationale, Results ppt v1.0 March 30, 2005 Mark Stoeckle, The Rockefeller University Paul E. Waggoner, Connecticut Agricultural Experiment Station Jesse H. Ausubel, Alfred P. Sloan Foundation Barcoding is a standardized approach to identifying plants and animals by minimal sequences of DNA, called DNA barcodes. DNA Barcode: A short DNA sequence, from a uniform locality on the genome, used for identifying species. 2. What are the benefits of standardization? • Results so far suggest that a mitochondrial gene will enable identification of most animal species. • Focus to date: For animals, a 658 base-pair fragment of the mitochondrial gene, cytochrome oxidase subunit I (mtCOI). • For plants, mitochondrial genes do not differ sufficiently to distinguish among closely related species. Promising approaches to standardize plant identification use one or possibly more barcode regions are under development. Why barcode animals with mitochondrial DNA? Mitochondria, energy-producing organelles in plant and animal cells, have their own genome. Twenty years of research have established the utility of mitochondrial DNA sequences in differentiating among closely-related animal species. Four properties make mitochondrial genomes especially suitable for identifying species: • Copy number. There are 100-10,000 more copies of mitochondrial than nuclear DNA per cell, making recovery, especially from small or partially degraded samples, easier and cheaper. • Relatively few differences within species in most cases. Small intraspecific and large interspecific differences signal distinct genetic boundaries between most species, enabling precise identification with a barcode. • Introns, which are non-coding regions interspersed between coding regions of a gene, are absent from mitochondrial DNA of most animal species, making amplification straightforward. Nuclear genes are often interrupted by introns, making amplification difficult or unpredictable. What do barcode differences among and within animal species studied so far suggest? • Barcodes identify most animal species unambiguously. • Approximately 2-5% of recognized species have shared or overlapping barcodes with closely-related species. Many of the species with overlapping barcodes hybridize regularly. • In all groups studied so far, distinct barcode clusters with biologic co-variation suggest cryptic species. Barcodes affirm the unity of the species Homo sapiens. Comparisons show we differ from one another by only 1 or 2 nucleotides out of 648, while we differ from chimpanzees at 60 locations and gorillas at 70 locations. What are the main limits to barcoding encountered so far? • Groups with little sequence diversity • Resolution of recently diverged species • Hybrids • Nuclear pseudogenes Příklad: Myotis blythii vs. Myotis myotis - introgrese mtDNA Příklad: Myotis blythii vs. Myotis myotis - introgrese mtDNA Příklad: Myotis blythii vs. Myotis myotis - introgrese mtDNA Who is advancing barcoding? Identifikace jedince - metody • DNA fingerprinting (název dnes používán pro různé metody) - velké množství kvalitní DNA - technická náročnost +univerzalita • AFLP - kvalitní nedegradovaná DNA +univerzalita • Sekvenování, alozymy - nemusí rozlišit jedince • Mikrosatelity + stačí malé množství nekvalitní DNA, optimální pro neinvazivní přístupy - je nutné znát konkrétní lokusy a sekvence specifických primerů Multi-locus genetic markers • Mnoho znaků náhodně rozmístěných v genomu Ø minisatellite DNA fingerprinting (celogenomová RFLP) Ø AFLP (amplified fragment length polymorphism) • presence vs. absence = dominantní znaky (neodliší heterozygota) RFLP (restriction fragments length polymorphism) a AFLP (amplified fragments length polymorphism) • Základem je naštípání DNA restrikčními enzymy • → milióny fragmentů různé délky • Rozdíly díky: – přítomnosti/absenci restrikčních míst – tandemovým opakováním (mikrosatelity, minisatelity) – delece a inzerce • Zviditelnění jen určité části fragmentů Enzyme Site Recognition Common Restriction Enzymes Každý jedinec má jedinečný genom Každý jedinec má jedinečný genom Každý jedinec má jedinečný genom DNA fingerprinting • Jeffreys et al. 1985 – „naštípání“ DNA pomocí restrikčního enzymu – Rozdělení fragmentů pomocí elektroforézy – Hybridizace (jako sonda minisatelit, např. Alu) • Dostatek kvalitní DNA • Vše na jednom gelu • Laboratorní náročnost AFLP • Naštípání DNA restrikčními enzymy • Navázání adaptérů • Amplifikace primery o nukleotid delšími než je adaptér (jinak sekvence komplementární k adaptéru) • Amplifikace primery o nukleotid delšími než je adaptér (jinak sekvence komplementární k adaptéru) • Amplifikace značenými primery o 3 nukleotidy delšími než je adaptér • Detekce – gely, sekvenátor Single-locus genetic markers • kodominantní – možno stanovovat frekvence alel • allozymy a jiné funkční geny - MM • mikrosatelity – délkový polymorfismus • SNPs (single nucleotide polymorphisms) – sekvenční polymorfismus • SINE, LINE mikrosatelity • Tandemová opakování krátkých motivů • Izolace DNA • PCR • Detekce → sekvenátor, fragmentační analýza Identifikace jedinců závisí na stupni polymorfismu • multilocus microsatellite fingerprinting – power estimated as „probability of identity“ (P[(ID)]) (Waits et al. 2001) Medvědi v Pyrenejích Taberlet et al. 1997 • Trus a chlupy • 24 mikrosatelitových lokusů • 4 samci a jedna samice (o jednoho víc než podle stop a fotografií) • Multiple-tube approach, mnohonásobné opakování PCR reakcí Lidská forenzní genetika • Pozůstatky vojáků z války Vietnam a Korea Identifikace na základě mtDNA příbuzných osob (lze jen někdy) V současnosti: vzorek DNA (krve) při odvodu, jiné markery Armed Forces Repository of Specimen Samples for the Identification of Remains • Soudní pře Clinton-Lewinská Pozůstatky ruského cara Nikolaje II • Kriminalistika • Oběti tragických událostí Klony Bambus Sasa senanensis • Suyama et al. 2000 • Plocha 10 hektarů • AFLP • 22 klonů • Klon na ploše 300 m v průměru Slavní klonální bezobratlí • Rotifera – Bdelloidea • Ostracoda (Darwinula) • Partenogenetické klony vysokého stáří (milióny let) Genetické chiméry • organismy složené z buněk s různými genotypy • Dictyostelium discoideum chimérismus je pravidelná součást života Genetické chiméry • Ficus srůst kořenů různých jedinců • Botryllus schlosseri chimérické kolonie příbuzní jedinci • Diplosoma listerianum i nepříbuzní Celleporella hyalina (Bryozoa) Hughes et al. 2004 • Pravděpodobnost fůze koreluje s příbuzností • Histokompatibilita • Lepší rozpoznávání v pokročilejších fázích → dozrávání imunokompetence • Specielní proteiny (spongikany...) Genetické chiméry • Callithrix jacchus (asi i Saguinus) • Dizygotická dvojčata • DNA fingerprinting krve • Jsou to hematopoietické chiméry • Během embryonálního vývoje vzájemná výměna buněk kostní dřeně • Týká se to asi jen krve (neinvazivní metody – chlupy, trus →jeden genotyp) • Průnik embryonálních erytroblastů a volné DNA přes placentu u člověka • (pohlaví dítěte před narozením lze určit i pomocí PCR sekvencí typických pro Chr Y, jako templát periferní krev matky) Genetická identifikace pohlaví • druhy s nevýrazným pohlavním dimorfismem (ptáci) • zárodky v ranném stádiu ontogeneze (embrya) • neinvazivní metody (trus, skořápky, šupiny) Genetická identifikace pohlaví • druhy s genetickou determinací pohlaví (tj. nejčastěji pohlavní chromozómy) • ptáci (♂=ZZ, ♀=ZW) • savci (♂=XY, ♀=XX) • amplifikace DNA oblasti specifické pro heterogametické pohlaví • W, Y – malé chromozómy Určení pohlaví – ptáci Griffith et al. 1998 • CHD1W a CHD1Z, geny na pohlavních chromosomech (chromobox-helicase-DNA-binding gene (CHD) – Griffiths & Tiwari 1995) • Primery amplifikují introny obou genů • Introny se mohou lišit délkou • Existují už tři možnosti běžně používaných primerů • Problematické druhy Struthioniformes Manorina melanocephala (Meliphagidae) Arnold et al. 2001 • Synové fungují jako pomocníci • U adultů 2,31 samců na 1 samici • Mláďata v hnízdě poměr pohlaví 1:1 (57:57) • První se líhnou samci (v 17 hnízdech z 18) Při opouštění hnízda jsou větší a těžší Určení pohlaví - savci • Amplifikace genu na Chr Y (Sry) (nejlépe duplex PCR s genem na X nebo autosomech) • Sry DNA-binding motif (HMG box) velmi podobný u vačnatců i placentálů • Microtus cabrerae Sry na Chr X Ellobius, Tokudaia Sry zcela chybí Určení pohlaví - savci • Amplifikace genu na Chr Y (Sry) (nejlépe duplex PCR s genem na X nebo autosomech) • Sry DNA-binding motif (HMG box) velmi podobný u vačnatců i placentálů Určení pohlaví – jiné skupiny • Chr Y občas i u rostlin Rumex • Plazi Calotes versicolor Sry má i 50% samic! • Hledání markerů pomocí nespecifických metod (RAPD, AFLP)