Paternita x maternita x rodičovský pár Známe jednoho rodiče Historie • již první studie genetického polymorfismu ® genetické techniky mohou rozlišit nejisté otcovství ® jedno z hlavních témat molekulární ekologie • chromosomal polymorphism • allozyme electrophoresis • DNA fingerprinting – overturn of existing paradigms in behavioural ecology (birds) • statistical techniques for single-locus polymorphism (allozymes) – departure from practice (i.e. DNA fingerprinting) Historie Využití mikrosatelitů (dnes nejčastěji používané markery pro stanovení paternity) • Spojení teorie (statistické modely) a praxe (vysoce polymorfní single-locus markery) • Tandemová opakování krátkých motivů • Např. (CTTT)[n ]nebo(CA)[n ] • Vysoce polymorfní • Jednoduchá mendelovská dědičnost - kodominantní Alely se liší délkou – analýza dvou jedinců Proteinový fingerprinting • Hohol severní Andersson & Åhlund 2000 • Proteiny z bílku vajec • isoelectric focusing in immobilized pH gradients • Vnitrodruhový hnízdní parazitismus (více něž polovina hnízd) • Zanáší si zřejmě příbuzné samice Statistical methods of parentage analysis • Exclusion (vyloučení) nekompatibilita mezi rodičem a potomkem ® zamítnutí rodičovství • Categorical and fractional likelihood nelze vyloučit více jedinců – pravděpodobnost závisí na frekvencích alel v populaci • Parental reconstruction z genotypů potomků z jedné rodiny rekonstrukce genotypu rodičů srovnání se skupinou potenciálních rodičů nebo srovnání navzájem mezi potomky k určení „multiple paternity“ Určení paternity – exclusion principle Fragmentační analýza Kolik je třeba lokusů? • Nutný počet není absolutní • Dáno: ü počtem alel ü heterozygotností ü četností alel ü velikostí vzorku • ideální - hypervariabilní lokusy stačí třeba jen 3 • Tedy nejdříve je nutná pilotní studie dospělců v populaci • → výpočet Exclusion probability Exclusion probability • Pravděpodobnost, že genotyp náhodně vybraného jedince nebude pasovat na potomka • Závisí na počtu lokusů a alel • Jiné hodnoty pro prvního a druhého rodiče • Dobré jsou hodnoty okolo 0,99 • Vypočítá například Cervus • od v. 3.0 výše už počítá „the combined non-exclusion probabilities across all loci“ = these represent the average probability of not excluding a single randomly-chosen unrelated individual from parentage at one or more loci. (dobré jsou hodnoty pod 0,01) Exclusion - komplikace • Mendelian rules of inheritance: genotyping errors, null alleles, mutations ® false exclusions in strict conditions „Null alleles“ a „genotyping error“ lokus 1 lokus 2 null alleles genotyping error Matka 100 150 300 350 Samec 1 100 100 300 367 Mládě 150 150 350 365 Exclusion - komplikace • Mendelian rules of inheritance: genotyping errors, null alleles, mutations ® false exclusions in strict conditions • Extended family structure (příbuznost potenciálních rodičů) – nejhorší jsou sourozenci • Linked loci – decrease of variation • Loci on sex chromosomes • Problémy narůstají s rostoucím množstvím jedinců a lokusů • „Exclusion“ je velmi užitečná metoda např. v experimentech, kde jsou všichni rodiče předem známi a zgenotypováni Př.: Faktory ovlivňující celoživotní fitness u hořavky duhové Př.: Faktory ovlivňující celoživotní fitness u hořavky duhové Mutace Ibarguchi et al. 2004 • Obvykle se zanedbávají • Mohou však být i poměrně časté – vysoká mutační rychlost mikrosatelitů (4.5 x 10^-2 - 5.1 x 10^-6 na lokus) • Navíc častější u samců (2 až 6x) • → Vyloučení na základě jednoho lokusu může být špatně !!! Řešení • Použít více lokusů • Probability of resemblance (P[R]) Podívám se na ostatní lokusy a vypočítám s jakou pravděpodobností mohou alely sdílet dva nepříbuzní jedinci. Uria lomvia • 22% mimopárová paternita bez korekce na mutace • 7% mimopárová paternita s korekcí soulad s jinou použitou technikou Categorical x fractional likelihood • „likelihood“ skóre je vypočítáno na základě genotypů potomka a všech nevyloučených rodičovských genotypů (na základě frekvencí alel v populaci) • Categorical l.: potomek jako jednotka přiřazen otci, biologicky validní • Fractional l.: potomek přiřazen všem kompatibilním otcům. Statisticky přesnější a proto někdy výhodnější (např. lepší pro srovnání reprodukčního úspěchu různých kategorií samců) Categorical allocation • hledáme otce • hledáme matku c) hledáme oba rodiče d) hledáme oba rodiče, ale neznáme pohlaví jednotlivých kandidátů ... více viz program CERVUS Fractional allocation • přiřadí určitou frakci (mezi 0 a 1) každého potomka všem nevyloučeným kandidátním rodičům • the portion of an offspring allocated to a particular candidate parent is proportional to its likelihood of parenting the offspring compared to all other nonexcluded candidate parents Megaptera novaeangliae Nielsen et al. 2001 • Až 25 samců se pokouší pářit se samicí • Různé role samců - dominantní společník a vyzyvatel, sekundární společníci • 6 mikrosatelitových lokusů • Fractional likelihood paternity method • Dominantní samci mají asi 3x více mláďat (je to ale neprůkazné) Categorical and fractional likelihood - nevýhody • male’s likelihood of paternity is positively related to his homozygosity (homozygotes have higher likelihood to have the same allele with the progeny) ® be carefull when estimating variance in reproductive success • categorical – overestimate the reproductive success of homozygotes and underestimate that of heterozygotes • fractional – a priori equal probability of paternity (required by the technique) underestimates variance in reproductive success Genotypic (parental) reconstruction • rekonstrukce parentálních genotypů z velkého množství genotypů potomků (full- or halfsibs) • exhaustive algorithm • extremely computationally intensive • nejčastěji při analýzách paternity u ryb Choosing the method • sampling of unknown parents (all, some, none) • sampling large groups of full- or halfsibs (yes, no) • a priori known parents (both, one, neither) Počítačové programy • Cervus, Newpat, Probmax, Kinship, Famoz, Papa, Parente, Patri, Gerud • available online – see Jones & Ardren (2003) • the most important differences – handling sources of difficulty (null alleles, mutations, scoring errors) Co je nejdůležitější? • Kvalitní data z terénu či experimentů! • Nejlépe všichni dospělci z populace, behaviorální a jiná fenotypická data, mláďata přiřazena do rodin (matka + sociální partner) • Špatná data = špatné výsledky Stane se, že nemohu získat vzorky všech dospělých jedinců z populace (potenciálních rodičů) nebo nelze říci, která mláďata jsou z jedné rodiny • Nemusí se zdařit najít rodiče všem potomkům • I tak ale mohu zjistit ledacos zajímavého (multiple paternity) Příklad genotypy matky a embryí lokus 1 lokus 2 Matka 100 150 300 350 1. embryo 100 115 300 320 2. embryo 150 120 350 310 3. embryo 120 100 350 365 Alely od matky lokus 1 lokus 2 Matka 100 150 300 350 1. embryo 100 115 300 320 2. embryo 150 120 350 310 3. embryo 120 100 350 365 Na druhém lokusu více než dvě alely, které nejsou od matky → více otců Apodemus agrarius mláďata až od tří samců Orangutan na Sumatře (paternity) • Nápadný dimorfismus (vystouplé tváře a hrdelní vaky u samců) • Předpoklad: Samci bez nápadných znaků hormonálně suprimováni a nemnoží se • Mikrosatelity – 50 % mláďat je od samců bez nápadných znaků → alternativní strategie Lepomis (maternity) • Samec (bourgeois male) hlídá hnízdo s jikrami • L. marginatus, L. punctaus, L. auritus samec má v hnízdě jikry od několika samic • L. macrochirus tři typy samců (alternativní reprodukční strategie): bourgeois (> 7 let, staví hnízda) mladí samci (vjíždějí do hnízd a vypouštějí spermie) nespárovaní staří samci (napodobují samice) 20% potomků není od bourgeois Skladování spermií • Dny u savců týdny u ptáků nebo hmyzu měsíce u mloků roky u hadů a želv • Chrysemys picta mikrosatelity → po 3 roky mláďata od stejného otce, opakované páření se stejným otcem je nepravděpodobné Ptáci • Řada druhů považována za monogamní (pěvci) • Ale u 75 % druhů ptáků mimopárová mláďata • Skutečně monogamní pěvci – jen 14% (Phylloscopus) Odhad % mimopárových mláďat • Dostatečný vzorek pro odhad • Více než 200 Halichoerus grypus tuleň kuželozubý Wilmer et al. 1999 • Samci z centra kolonie úspěšnější (až 30x) • Samci reprodukčně aktivní 10 let i déle • Pro více než polovinu mláďat nenalezeni otci → role páření ve vodě • Kolonie, dimorfismus→ polygynie • Dvě skotské kolonie North Rona a Isle of May • Vzorky ze zhruba deseti let • 9 mikrosatelitových lokusů • IDENTITY, NEWPAT, CERVUS Nejčastěji používané programy • CERVUS • NEWPAT • FAMOZ • a další CERVUS • využívá výpočtu likelihood • přidává váhu jednotlivým alelám na základě jejich frekvence • možnost nastavení míry genotypizační chyby, bere v úvahu nulové alely CERVUS PRVNÍ VERZE • Marshall TC, Slate J, Kruuk LEB, Pemberton JM (1998) Statistical confidence for likelihood-based paternity inference in natural populations. Molecular Ecology 7 (5) , 639–655 AKTUÁLNÍ VERZE 3.0 • Kalinowski ST, Taper ML, Marshall TC (2007) Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment. Molecular Ecology 16: 1099-1006. DOWNLOAD - www.fieldgenetics.com CERVUS Možnost použití a) hledáme otce b) hledáme matku c) hledáme oba rodiče d) hledáme oba rodiče, ale neznáme pohlaví jednotlivých kandidátů Typický příklad: Maternita a paternita u netopýrů Omezení v programu CERVUS • pouze diploidní data • pouze kodominantní lokusy (např. mikrosatelity) • lokusy nesmí být ve vazbě (test v Genepop 4.0) • jen malé odchylky od HW rovnováhy Vstupní soubor • 2 možnosti – vytvoření csv souboru v MS Excell – konverze z formátu jiného programu (Genepop, Kinship, Genetix) Vytvoření csv souboru Input file – konverze z jiného formátu Příklad – konverze z Genetix Načtení dat do Cervus Analýza dat Analýza dat Analýza dat Analýza dat – výstup simulace Analýza dat 3) Vlastní určení paternity (a/nebo maternity) Analýza dat Analýza dat Výstup • před otevřením souboru s výstupem je třeba opět vyměnit čárky za středník • mismatch – nesedící alely, nemožné zdědit po rodičích (může být ale způsoben nějakou chybou) • non-exclusion probability – pravděpodobnost, že nepříbuzný kandidát není vyloučen jako rodič • znak * označuje otce/matky určené s 95% pravděpodobností • znak + označuje otce/matky určené s 80% pravděpodobností • znak – označuje nejpravděpodobnějšího otce/matku, který ale není určen jako rodič PŘÍKLADY PŘÍKLAD 1 • máme 5 mláďat, známe jejich matky • existuje 10 potencionálních otců, každý z kandidátů může být otcem každého z mláďat • soubory: genotypy, mláďata, otcové • máme 5 mláďat, neznáme jejich matky ani otce, zajímají nás jen matky • existuje 10 potenciálních matek pro všechna mláďata • soubory: jen genotypy2, ostatní soubory je třeba vytvořit • 10 mláďat, neznáme ani otce, ani matku • k dispozici genotypy 10 samců a 15 samic • soubory – jen genotypy3, zbytek je třeba vytvořit • opět 5 mláďat, známe jejich matky • pro každé mládě existují 4 kandidátní otcové (označení kand, číslo mláděte, písmeno a-d) • soubory – pouze genotypy4, zbytek třeba vytvořit