Transkripce a úpravy RNA Genová exprese: cesta od DNA k RNA a proteinu Informační kapacita DNA Přepis genetické informace z DNA do RNA: transkripce • převedení informace v podobě sekvence deoxyribonukleotidů v DNA do sekvence ribonukleotidů v RNA (transkriptu) • informace si uchovává podobnou chemickou povahu • jedno vlákno DNA genu se použije jako templát pro syntézu komplementárního vlákna RNA • kóduje-li transkript protein, podrobí se translaci na ribozomech, tj. informace skrytá v sekvenci ribonukleotidů se převede do pořadí aminokyselin v proteinech Transkripce se významně podílí na regulaci genové exprese • geny mohou být podrobeny transkripci a translaci s různou účinností • některé proteiny se proto tvoří v mnohonásobně vyšších množstvích než jiné Transkripce a translace u prokaryot Transkripce a translace u eukaryot Introny a exony • introny: nekódující sekvence přítomné v genech eukaryot • exony: exprimované sekvence eukaryotických • sekvence zahrnující introny i exony se transkribují do pre-mRNA • nekódující sekvence se následně vyštěpují sestřihovými úpravami ("splicing") ve speciálních makromolekulárních komplexech zvaných spliceozomy Prostorová struktura RNA • přes malé chemické odlišnosti je struktura RNA podstatně odlišná od DNA • DNA je v buňkách v podobě pravidelné dvoušroubovice, RNA je jednořetězcová • řetězec RNA se skládá do specifického tvaru (párováním bází uvnitř téže molekuly) podobně jako polypeptidový řetězec proteinu Transkripce má několik stejných rysů jako replikace DNA • začíná rozvolněním malé oblasti dvoušroubovice DNA: obnažení několika bází obou řetězců • jeden z řetězců DNA slouží jako templát pro syntézu komplementárního vlákna (RNA) • výběr začleňovaného nukleotidu vyplývá z párování komplementární bází • nový nukleotid je do rostoucího vlákna začleněn kovalentní vazbou enzymatickou reakcí • vzniklá RNA je přesnou komplementární verzí templátového řetězce • syntéza RNA probíhá ve směru 5’è3’ Odlišnosti transkripce a replikace • prekurzory jsou ribonukleozidtrifosfáty a ne deoxyribonukleozidtrifosfáty • transkribuje se jen jedno vlákno DNA • syntéza RNA může být iniciována de novo • vzniklý řetězec RNA nezůstává připojen vodíkovými vazbami k DNA, ale odvíjí se od něj, čímž umožňuje obnovení dvoušroubovicové struktury DNA • transkripty se z templátu uvolňují jako jednořetězce • velikost transkriptů je podstatně menší než velikost genomu • transkripci zajišťuje DNA-dependentní RNA polymeráza, zatímco replikaci katalyzuje DNA-dependentní DNA polymeráza Odlišnosti RNA a DNA polymeráz • odlišná chemická povaha substrátů a produktů reakce • RNA polymerázy mohou katalyzovat tvorbu RNA za nepřítomnosti primeru • RNA polymerázy jsou méně přesné než DNA polymerázy (1 chyba/10^4 nukleotidů versus 1 chyba /10^7 nukleotidů) Pro transkripci se využívá jen jedno vlákno DNA kódující (templátové) vlákno je určeno signálními sekvencemi RNA polymerázy • katalyzují tvorbu fosfodiesterových vazeb mezi nukleotidy a vytvářejí tak lineární řetězec • pohybují se podél DNA, postupně rozvíjejí dvoušroubovici, obnažují templátový řetězec pro párování s komplementárními bázemi • vznikající řetězec RNA se prodlužuje ve směru 5´-3´ • substráty polymerace jsou nukleosidtrifosfáty ATP, CTP, UTP a GTP • nutnou energii poskytuje hydrolýza makroergických vazeb Proces transkripce je rychlý • vzniklá RNA se rychle uvolňuje z templátu • transkripce téhož genu může být zahájena ještě před dokončením transkipce předchozí • stejný gen může být podroben opakované transkripci v krátkém čase • RNA polymeráza se pohybuje rychlostí 20 nukleotidů za sekundu (u eukaryot) • za hodinu se může vytvořit více než 1000 transkriptů téhož genu Iniciace transkripce u prokaryot • k jádru enzymu se připojuje sigma faktor a vzniká tak holoenzym RNA polymerázy • tento komplex klouže po molekule DNA dokud se znovu nerozpadne • pokud při pohybu po DNA narazí na nukleotidovou sekvenci (promotor), naváže se na ni pevněji • promotor nastavuje RNA polymerázu k startovnímu bodu transkripce • za rozeznání promotoru zodpovídá sigma faktor RNA polymerázy, který vytváří specifické kontakty s bázemi promotoru Iniciace transkripce u prokaryot: 3 kroky 1. holoenzym RNA polymerázy se váže do promotorové oblasti DNA 2. přítomnost RNA polymerázy způsobí lokální rozvinutí vláken DNA, dojde k obnažení bází templátu, aby se mohly párovat s ribonukleotidy 3. RNA polymeráza katalyzuje tvorbu fosfodiesterových vazeb mezi několika prvními nukleotidy vznikajícího vlákna RNA (po dokončení syntézy cca 10 prvních nukleotidů se oslabuje vazba mezi RNA polymerázou a promotorem a mezi jádrem enzymu a sigma faktorem, iniciace končí) Struktura prokaryotických promotorů - krátké konzervativní sekvence v oblastech vzdálených 35 a 10 nukleotidů proti směru transkripce od místa startu • sekvence -10: TATAAT (bohaté zastoupení AT usnadňuje rozvíjení dvoušroubovice) • sekvence -35: TTGACA (rozeznávací sekvence, na kterou se váže sigma faktor Elongace řetězce RNA u prokaryot • katalyzována RNA polymerázou po uvolnění σ faktoru • dochází k prodlužování RNA tvorbou kovalentních vazeb mezi ribonukleotidy • RNA polymeráza se pohybuje po templátu a postupně rozvíjí DNA tvorbou transkripční bubliny • za polymerázou se obnovuje dvoušroubovice DNA • vznikající vlákno RNA se vytěsňuje z templátu • oblast přechodného párování mezi DNA a RNA je velmi krátká (cca 3 páry bází) • rychlost: 40 ribonukleotidů za sekundu Terminace řetězce RNA u prokaryot • elongace transkripce pokračuje dokud enzym nezaznamená ve struktuře DNA terminační signál (terminátor) • v místě terminátoru se pohyb RNA polymerázy zastaví a transkripční komplex se rozpadá • dojde k uvolnění řetězce RNA i templátu DNA • uvolněná RNA polymeráza může znovu asociovat se sigma faktorem a znovu zahájit transkripci Terminační signály u E.coli: 2 typy • terminátory závislé na r (ro) - vyžadují proteinový faktor r • terminátory nezávislé na r - fungují za nepřítomnosti proteinu r Terminátory nezávislé na r • obsahují sekvence bohaté na GC, po kterých následuje šest nebo více párů AT • po přepisu do RNA v důsledku intramolekulárního párování bází GC vzniká vlásenka • tato vlásenka zpomaluje pohyb RNA polymerázy, což vede terminaci transkripce v přilehlé oblasti AU a uvolnění transkriptu Terminátory závislé na r • sekvence dlouhé 50 - 90 pb • transkripty vzniklé jejich přepisem jsou bohaté na C • protein r se váže k syntetizované RNA a pohybuje se po ní ve směru 5´- 3´(jako by sledoval RNA polymerázu) • jakmile se pohyb RNA polymerázy na terminátoru zpomalí, protein r ji dostihne a zajistí uvolnění vlákna RNA z transkripční bubliny Transkripce a úpravy RNA u eukaryot odlišnosti od prokaryot: • RNA je syntetizovaná v jádře, ale proteiny v cytoplazmě • eukaryotické transkripty jsou monogenní • populace primárních transkriptů v jádře se označuje heterogenní jaderná RNA (hnRNA) • transkripty se pokrývají proteiny již během své syntézy (ochrana před degradací ribonukleázami) • 3 typy RNA polymerázy (I, II, III), které jsou strukturně podobné, ale transkribují různé typy genů • primární transkripty genů kódujících polypeptidy podléhají před transportem do cytoplazmy třem modifikacím: - na 5´konce primárních transkriptů se váže 7-metylguanozinová čepička - na 3´konce primárních transkriptů se vážou sekvence poly(A) (tj. sekvence A dlouhá 20 - 200 nukleotidů) - z primárních transkriptů se vystřihují sekvence intronů Tři typy RNA polymeráz u eukaryot • 3 typy RNA polymerázy (I, II, III), které jsou strukturně podobné, ale transkribují různé typy genů: • RNA polymeráza I: geny kódující 5,8S, 18S a 28S rRNA • RNA polymeráza II: geny kódující proteiny, miRNA, siRNA a většinu snRNA • RNA polymeráza III: geny kódující tRNA, 5S rRNA, některé snRNA a další malé RNA Vlastnosti eukaryotických RNA polymeráz • obsahují 10 nebo více podjednotek • pro správnou funkci nutná pomoc většího počtu transkripčních faktorů • jednotlivé typy se liší citlivostí k houbovému jedu α-amanitinu (producentem je houba Amanita phalloides): - RNA polymeráza I je zcela rezistentní - RNA polymeráza IIje citlivá i k nízkým koncentracím - RNA polzmeráza III je citlivá k vyšším koncentracím α- amanitin lze použít pro určení typu RNA polymerázy, transkribující určitý gen Iniciace transkripce u eukaryot • na rozdíl od prokaryot závislá na pomocných proteinech, které se vážou na promotory a účastní se tvorby iniciačního komplexu • teprve následně se k DNA připojuje RNA polymeráza • RNA polymerázy I, II a III používají různé promotory Příklad promotoru RNA pol II: TATA box a CAAT box jsou přítomny u promotorů většiny genů RNA pol II Hlavní složky eukaryotických promotorů RNA pol II 2 hlavní konzervativní elementy: TATA box: • konzervativní sekvence TATAAAA v netemplátovém vlákně • umístěn v oblasti -30 • důležitý pro správné umístění transkripčních faktorů vzhledem k počátku transkripce CAAT box: • konzervativní sekvence GGCCAATCT v netemplátovém vlákně • umístěn v oblasti -80 • ovlivňuje účinnost iniciace transkripce Bazální transkripční faktory • uvádějí RNA polymerázu přesně na promotor a ke startovacímu nukleotidu • podílejí se na rozvolnění řetězců DNA před začátkem transkripce • uvolňují RNA polymerázu z promotoru při přechodu z iniciace do elongace • fungují na téměř všech promotorech RNA polymerázy II • označují se TFIIX (Transcription Factor for polymerase II, kde X je písmeno specifické pro daný faktor) Přerušované geny: exony a introny • v roce 1977 překvapivý objev: většina eukaryotických genů obsahuje nekódující sekvence - introny („intervening sequences“) - které přerušují sekvence kódující - exony (exprimované úseky) • počet intronů a jejich délka u různých genů značně kolísá • exony i introny jsou podrobeny transkripci za vzniku hnRNA • přepisy intronů jsou následně z hnRNA odstraněny sestřihem za vzniku zralé mRNA • teprve zralá mRNA se transportuje do cytoplazmy, aby se podrobila translaci