16
2 Histologie buněk imunitního systému
Buňky v krevním řečišti, které vykonávají imunologické funkce se obecně označují jako leukocyty bílé
krvinky. Jejich název je odvozen od bílé vrstvy, kterou formují během centrifugace plné krve. Tyto
buňky jsou schopné vycestovat z krevního řečiště a pronikat do okolních tkání, kde provádí imunitní
dozor. Jejich zastoupení v pojivech, zejména řídkém vláknitém pojivu je natolik významné, že jsou
považovány za součást této tkáně a nazývají se zde volné buňky pojiva (např. histiocyty, žírné buňky,
makrofágy...).
Základní dělení leukocytů je podle obsahu barvitelných granul:
1. Granulocyty (neutrofily, eosinofily, basofily)
- obsahují specifická granula, která se barví podle typu kyselými nebo bazickými
komponentami barvící směsí podle Pappenheima
- obsahují azurofilní granula, jež jsou považována za lyzozomy a barví se purpurově
2. Agranulocyty (monocyty, lymfocyty, makrofágy)
- neobsahují specifická barvitelná granula, ale obsahují azurofilní granula
Člověk Myš
Absolutní počty [počet v litru]
Erytrocyty 5x10
12
8x10
12
Leukocyty 5-8x10
9
6-15x10
9
Relativní počty [v %]
Granulocyty
Neutrofily 50 ­ 70 5 ­ 34
Neutrofilní tyčky 3 ­ 5
Heterofily ­ Eosinofily
2 ­ 4 0 ­ 4
Basofily 0 ­ 1 0 ­ 1
Agranulocyty
Monocyty 3 ­ 8 0 ­ 3
Lymfocyty 18 ­ 40 60 ­ 95
Tab 1. Zastoupení krevních buněk v periferní krvi různých živočichů. Absolutní počty udávají počet
krevních buněk v 1 litru, zatímco relativní vyjadřují krevní diferenciál a udávají procentuální zastoupení
daného typu leukocytů z celkového počtu leukocytů. Některé hodnoty nelze zobecnit a jejich hodnoty
jsou popsány v následujícím odstavci.
Počet bílích krvinek kolísá i v průběhu dne. Ráno jich je nejméně, odpoledne nejvíce. Za
fyziologických podmínek nastává pouze mírná diference v počtu leukocytů, větší úbytek nebo zvýšení
počtu nastává jen za chorobných stavů.
U poikilotermních živočichů má největší vliv na hodnoty leukocytů roční období, neboť je spojené
s kolísáním teploty. V letních obdobích mají více lymfocytů a heterofilů než v zimních obdobích. U
hibernujících plazů je během hibernace nejvyšší hladina eosinofilů. Množství basofilů u nižších
obratlovců je velmi nízké a liší se druh od druhu. U některých plazů lze však najít až 40 % basofilů
(např. některé želvy). Nízké hodnoty lymfocytů pozitivně korelují s hladověním a stresem u živočichů
pocházejících z přírody. Obecně lze říci, že hodnoty imunitních buněk jsou velmi závislé na prostředí
ve kterém se daný živočich pohybuje. Proto lze spolehlivé a reprodukovatelné hodnoty zajistit jen u
domestikovaných druhů, které jsou chovány za určitých standardních podmínek. Ze všech výše
uvedených důvodů je jasné, že hodnoty v tabulce jsou velmi hrubé zobecnění. U ryb se vyskytuje
v periferní krvi vysoké množství leukocytů, neboť jsou v krvi běžně přítomna vývojová stádia těchto
buněk.
17
ÚLOHA 1: Mikroskopování krevních nátěrů člověka a myši
Metoda, kterou se určuje procentuální zastoupení jednotlivých typů leukocytů v periferní krvi, se
nazývá krevní diferenciál. Je to metoda velmi jednoduchá a rychlá, spočívající v přípravě krevního
nátěru z periferní krve (cca 5 l) a následného obarvení kyselým a bazickým barvivem. Podrobný
popis najdete v sekci Obecné laboratorní postupy. Výsledný nátěr se pozoruje pod světelným
mikroskopem. Jednotlivé pozorovatelné typy leukocytů jsou popsány v následujícím textu.
Výstup
Zakreslete všechny nalezené typy leukocytů člověka. Poté pozorujte myší nátěry a porovnejte rozdíly
u člověka.
2.1 KREVNÍ OBRAZ ČLOVĚKA
2.1.1 Neutrofily
U nezralých neutrofilů má jádro segmentaci pouze
naznačenou a tento typ buňky se nazývá tyčka
nebo tyč (obrázek dole vpravo). Jaderná hmota
obsahuje hrudky chromatinu, jadérka nejsou
patrná. U samic savců je někdy na neutrofilech
pozorovatelné tzv. Barrovo tělísko kondenzovaný
X chromozóm, který se jeví jako
paličkovitý přívěšek na jednom segmentu. Ve zralých neutrofilech je cca jedna třetina granul
azurofilních (primární lyzozomy) a dvě třetiny tvoří granula specifická. Specifická granula se barví
velmi slabě kyselými a bazickými barvivy a na preparátu pak působí jako slabě granulózní cytoplasma.
Mitochondrie a proteosyntetický aparát je málo vyvinutý, drsné endoplasmatické retikulum chybí.
Absence drsného endoplasmatického retikula stejně jako absence jadérek naznačuje nízkou úroveň
proteosyntézy. V cytoplazmě neutrofilů je dále obsažen glykogen, což souvisí se schopností neutrofilů
přežívat i v anaerobním prostředí (např. v částečně nekrotických tkáních) a dokonce v těchto
podmínkách vykonávat své imunologické funkce.
Neutrofily jsou terminální stadia buněk, v oběhu žijí jen 6 ­ 7 hodin, v tkáních je jejich poločas života
1 ­ 4 dny bez ohledu na to, zda fagocytují či nikoli.
Mezi nejvýznamnější receptory patří receptor
pro Fc fragment IgG (FcR) a receptor pro
C3b složku komplementu. Mezi další důležité
receptory patří TLR, receptory pro
hematopoetické stimulační faktory jako např.
faktor GM-CSF nebo G-CSF, receptory pro
složky komplementu C5a a C3a, které
působí jako anafylatoxiny a celá řada dalších
receptorů.
Hlavní funkcí neutrofilů je fagocytóza částic za účelem jejich
destrukce bez následné prezentace antigenu. Tuto funkci neutrofily
realizují v několika dílčích krocích:
1. adherence a chemotaxe: část neutrofilů cirkuluje jakoby
uprostřed krevního proudu v cévách, část se pohybuje
relativně pomalu podél endotelu. Při zánětu, kdy dochází
ke zvýšené produkci adhezívních molekul se dramaticky
zvyšuje adherence na cévní stěny v místě zánětu a průnik
do tkání. Za fyziologického stavu je výskyt neutrofilů
v tkáních spíše vzácný. V průběhu zánětu je cílená migrace
neutrofilů do tkání ovlivňována tzv. chemotaktickými
Množství: 60 ­ 70 % cirkulujících leukocytů
Velikost: 10 ­ 12 m
Tvar jádra: 2 ­ 5 segmentů spojených tenkou
spojkou z jaderné hmoty
Nezralý neutrofil (tyčka)
Zralý neutrofil (segment) schéma
18
faktory, které jsou účinné již v nanomolárních koncentracích a během zánětu se jejich
koncentrace mnohonásobně zvyšuje. Obecně jsou zdrojem těchto chemotaktických faktorů
antigen prezentující buňky (APC), lymfocyty, trombocyty, endoteliální buňky, ale také samotné
bakterie. Jako příklad chemotaktických faktorů lze uvést: anafylatoxiny C5a, C3a, C4a, IL-8,
platelet activatig factor, složky bakteriálních povrchů aj.
2. fagocytóza: představuje pohlcování korpuskulárních částic, pinocytóza pak pohlcování kapalin
nebo koloidních roztoků. Pro zdárný průběh fagocytózy je nutná energie a funkční cytoskelet.
Výsledkem je tvorba fagosomu, který splyne s cytoplasmatickými granuly. Celý proces vede
k likvidaci pohlceného materiálu v takto vzniklém fagolyzozomu.
3. degranulace: je vlastní proces vylití obsahu granul do fagolyzozomu. Toto je přirozený
způsob, který vede k bezprostředné likvidaci pohlcené částice. Za určitých podmínek může
být obsah granul uvolněn do extracelulárního prostoru, pokud je tento proces masívní, může
vést k významnému poškození tkání v průběhu zánětu. Pokud dojde v neutrofilu k
degranulaci, nová granula se v důsledku nízké proteosyntézy už nemohou tvořit.
2.1.2 Eosinofily
Stejně jako u neutrofilů se i zde jedná o terminální
stadia buněk a mitochondrie, ER a Golgiho
komplex jsou málo vyvinuty. Eozinofily jsou trošku
větší než neutrofily, mají typicky dvousegmentové
(brýlovité jádro). Obsahují hodně specifických
granul (až 200), která se barví eozinem cihlově
červeně. I po obarvení těchto granul je však jádro
dobře patrné. Granula jsou výrazně větší než
granula neutrofilů. Vzhledem k tomu, že výsledné zbarvení granul se může mírně lišit podle způsobu,
resp. techniky barvení, bývá právě velikost granul hlavním rozpoznávacím kritériem. Granula obsahují
bílkovinu s výrazným zastoupením argininu, která se označuje hlavní bazický protein. Primární granula
jsou rovněž přítomna.
Eozinofily jsou buňky typicky se vyskytující
v tkáních, v periferním krevním oběhu je
jich řádově méně. Stejně jako neutrofily
patří mezi krátce žijící buňky s poločasem
života v krvi 6 -12 hodin a v pojivové tkáni
několik dní. Jsou schopny fagocytózy avšak
ve výrazně menší míře než neutrofily.
Hlavními receptory eozinofilů jsou receptory
pro imunoglobuliny IgE a IgG. Z funkčního
hlediska je důležitější receptor pro IgE
označovaný FcR, který existuje ve dvou formách s různou afinitou k molekule IgE. Dále se na
eozinofilech vyskytují také receptory pro komplement, nebývají však přítomny na všech buňkách.
Eozinofily hrají významnou úlohu v boji s endoparazity, zejména mnohobuněčnými helminty, kteří
parazitují ve tkáních. Předpokládá se, že v průběhu imunitní reakce dochází v tkáni k přímému
kontaktu většího počtu eozinofilů s parazitem a látky uvolňované z granul do extracelulárního prostředí
přímo narušují tkáně parazita. Zvýšený výskyt a zvýšená aktivace eozinofilů je součástí patologického
procesu u řady imunopatologických chorob, např. astmatu, atopické reaktivity a dalších.
2.1.3 Basofily
V periferní krvi jich je velmi málo, což
znamená že v krevním nátěru při klasickém
hodnocení jednoho sta buněk stěží najdeme
jeden bazofil. Jádro je méně kondenzované
než u ostatních granulocytů, bývá esovitého
tvaru a často je překryto specifickými
granulemi, protože tato se podobně jako jádro
Množství: 2 ­ 4 % cirkulujících leukocytů
Velikost: 12 ­ 14 m
Tvar jádra: 2 segmenty spojené tenkou
spojkou z jaderné hmoty
(brýlovité jádro)
Množství: Méně něž 1 % cirkulujících leukocytů
Velikost: 9 ­ 10 m
Tvar jádra: Esovité, někdy laločnaté, překryté
granulami
Eosinofil schéma
19
barví zásaditými složkami barviva. Hlavní komponentou specifických granul je histamin a heparin,
takže se mohou uplatnit při vazodilataci a koagulaci. Žijí také jen asi 1 den, maximálně týden.
Nejdůležitějším receptorem bazofilů je
vysokoafinní FcR. Bazofily vykazují řadu
podobností s žírnými buňkami, které se
v minulosti označovaly jako tkáňové
bazofily. Jedná se však o odlišné typy
buněk, vzniklé z jiných prekurzorů kostní
dřeně. Basofily se vyskytující pouze
v krevním oběhu.
2.1.4 Lymfocyty
Podle stupně diferenciace rozeznáváme
lymfocyty malé, střední a velké.
V periferním oběhu převládají malé
lymfocyty, které mají průměr 6 ­ 8 m.
Kulovité jádro, které vyplňuje téměř celou
buňku se intenzivně barví. Chromatin je
kondenzován ve formě hrubých zrnek. Cytoplazma se v krevních nátěrech jeví jako světle modrý úzký
lem okolo jádra a je bazofilní. V lymfocytech jsou obsaženy mitochondrie a proteosyntetický aparát.
Většina lymfocytů žije několik měsíců.
Vyjímku tvoří pouze tzv. paměťové buňky, ať
už diferencované z T lymfocytů nebo B
lymfocytů. Paměťové buňky jsou schopny
přežívat po celý život jedince.
Ve světelném mikroskopu nelze rozeznat,
zda se jedná o T nebo B lymfocyty a potíže
může činit i určení velkých lymfocytů pro
jejich podobnost s monocyty a NK buňkami.
Imunocytochemickými metodami bylo
zjištěno, že většina lymfocytů kolujících v krvi jsou dlouhožijící paměťové T lymfocyty. Pouze asi 15 %
cirkulujících lymfocytů jsou B lymfocyty, které se po antigenním podnětu mohou několikrát dělit
(proliferace) a vyzrát (diferenciace) v plazmatické buňky produkující ve tkáních protilátky. T i B
lymfocyty mohou vyzrát buď v tzv. efektorová stadia nebo v paměťové buňky, které mohou přežívat
v organismu mnoho let, patrně i po celý život jedince. U člověka a některých dalších savců dochází po
pubertě k postupné involuci thymu a jeho přeměně na tukovou tkáň. Přesto však zůstává buněčná
imunita funkční až do konce života. Není zcela jasné, zda a pokud ano tak kde se uskutečňuje
maturace a ,,školení" lymfocytů.
Vývoj lymfocytů je poměrně komplikovaný, některé detaily stále
nejsou zcela objasněny. Lymfocyty vznikají z lymfoidní pluripotentní
buňky v kostní dřeni. Diferenciace v imunokompetentní buňky se
uskutečňuje v primárních imunitních orgánech: thymu (T lymfocyty) a
kostní dřeni (B lymfocyty). U ptáků je za místo dozrávání B lymfocytů
považována Fabriciova burza, objevena v 60. letech minulého století.
Diferenciace v imunokompetentní buňky mimo jiné znamená, že
z celkové populace lymfocytů vytvořených v organismu se zachovají
pouze ty, které mají optimální afinitu k vlastním MHC molekulám,
resp. endogenním peptidům prezentovaným těmito molekulami.
Ostatní lymfocyty, jejichž receptory vykazují k těmto molekulám příliš
nízkou nebo naopak příliš vysokou afinitu zanikají procesem
apoptózy. Rozsah tohoto děje je obrovský: předpokládá se, že až 80 % vytvořených lymfocytů zaniká
v thymu z důvodu této ,,nevhodné" receptorové výbavy. Vysvětlení je pravděpodobně takové, že
lymfocyty v této své vývojové etapě exprimují celé spektrum receptorů příslušného živočišného druhu.
Množství: 24 ­ 40 % cirkulujících leukocytů
Velikost: 6 ­ 8 m
Tvar jádra: Kulaté, prakticky vyplňuje celou buňku
Basofil schéma
Malý lymfocyt schéma
Střední lymfocyt
20
To je z evolučního hlediska výhodné, protože se tím zvyšuje pravděpodobnost, že se vždy najde
jedinec v rámci populace, který bude svými receptory na imunitních buňkách schopen reagovat na
určitý (třeba atypický) antigen.
2.1.5 Monocyty
Největší buňky periferní krve, často jádro
s ledvinovitým výkrojem, který však nemusí být
v mikroskopu vždy patrný (záleží na tom
,,z které strany buňku pozorujeme"). Chromatin
je na rozdíl od lymfocytů méně kondenzovaný,
jádra se tudíž jeví jako světlejší než u
lymfocytů. Cytoplazma obsahuje jemná azurofilní granula (lyzozomy) která jsou na hranici
rozlišitelnosti světelného mikroskopu. Je třeba si uvědomit, že cytoplasma monocytů i lymfocytů
obsahuje určité malé množství granul jako např. lyzozomy nebo glykogenová granula. Ale na rozdíl od
granulocytů není obsah granul hlavní funkční a morfolofickou charakteristikou těchto buněk. Na
monocytech mohou být patrné i výběžky cytoplazmy, svědčící o probíhající fagocytóze. V jádře se
mohou vyskytovat jadérka a dobře je vyvinutý i proteosyntetický aparát.
Poločas setrvání monocytů v krvi je 12 ­ 100 hodin, poté zpravidla pronikají do tkání, kde se ve vazivu
diferencují na tkáňové makrofágy. Mezi nejvýznamnější makrofágy jsou např. Kupfferovy buňky
v játrech, alveolární makrofágy v plicních sklípcích, osteoklasty v kostní tkáni či mikroglie v tkáni
nervové. V tkáních pak mohou žít i několik měsíců.
Mezi nejvýznamnější receptory buněk
monocyto-makrofágové řady patří receptory
FcR a pro C3b složku komplementu. Tento
výčet je pouze orientační, v obou případech
mají monocyty k dispozici několik podtypů
těchto receptorů s různou afinitou a různou
mírou výskytu. Buňky monocytomakrofágové
řady exprimují na povrchu také
komplexy MHCII třídy díky kterým se řadí
mezi významné antigen prezentující buňky.
2.1.6 Trombocyty
Nejedná se o pravé buňky, ale o bezjaderné
okrsky cytoplazmy odškrcené z mateřské
buňky ­ megakaryocytu, který je polyploidní a
nachází se v kostní dřeni. Chybí jim tedy jádro
a nejsou schopny aktivní transkripce. Patří
mezi krátce žijící buňky, v periferní krvi
přetrvávají zhruba 10 dní. Membrána destiček je bohatá na glykosoaminoglykany a glykoproteiny a
má zřejmě význam pro adhezi destiček na poškozená místa v cévách a vzájemné agregace destiček.
Destičky obsahují velké množství granul, která jsou ohraničena membránou a obsahují také
glykogenové inkluze. V tzv. ­granulích je
obsažen fibrinogen. V krevních nátěrech je
vidíme často ve větších shlucích
nepravidelného tvaru.
Všechny funkce trombocytů nejsou ještě
dokonale prostudovány, ale jejich
nejdůležitější funkcí je bezesporu jejich
esenciální úloha v ochraně organismu před
ztrátou krve.
Pozn. Trombocyty, podobně jako erytrocyty, jsou bezjaderné pouze u savců. U ostatních obratlovců
se jedná už o pravé buňky s jádrem, většinou oválného tvaru, přičemž tvar buňky kopíruje tvar jádra.
Množství: 3 ­ 8 % cirkulujících leukocytů
Velikost: 12 ­ 20 m
Tvar jádra: Oválný až ledvinovitý tvar
Množství: 250 000 ­ 400 000 na l
Velikost: 2 ­ 4 m
Tvar jádra: bezjaderné
Monocyt schéma
Shluk trombocytů (světlé) schéma
21
2.1.7 Další buňky imunitního systému
V imunitní odpovědi se uplatňují i další málo početné typy buněk, které významně ovlivňují průběh
imunitní odpovědi např. dendritické buňky nebo NK buňky. Existence těchto a dalších minoritních
buněčných populací, stejně jako fakt, že v krevních nátěrech vidíme buňky různého stáří (některé
těsně po vyplavení z kostní dřeně, jiné těsně před zánikem) bývá příčinou toho, že někdy je obtížné
buňku jednoznačně zařadit do konkrétního typu. Někdy je vhodné při vizuálním hodnocení krevních
nátěrů přidat kategorii "neznámý typ", čímž se tento problém vyřeší.
Dendritické buňky
Dendritické buňky se v periferním oběhu vyskytují v množství odpovídajícímu cca 1 % všech
mononukleárních buněk, tedy ještě méně než např. bazofily. Pro tyto buňky jsou typické dlouhé
membránové výběžky, které se podobají dendritům nervových buněk a umožňují kontakt s ostatními
buňkami. Jejich jádro je nepravidelné a obsahuje malá jadérka. Nesou mnoho mitochondrií, ale málo
lyzozomů, ribosomů a endoplasmatické retikulum také není příliš vyvinuté.
Nezralé DC jsou vybaveny odpovídajícími receptory, které usnadňují jejich kontakt s mikrobiálními
agens. Velmi účinná je fagocytóza zprostředkovaná membránovými receptory, dále například
makropinocytóza. Kromě významných receptorů pro obecné patogení vzory (jako jsou například TLR,
MMR - Macrophage Mannose Receptor), mají tyto buňky na svém povrchu např. receptory FcR,
FcR a receptor pro C3b složku komplementu, prostřednictvím kterých jsou například účinně
endocytovány imunitní komplexy.
Dendritické buňky jsou nejdůležitější antigen prezentující buňky, které mají schopnost stimulovat
naivní T a B buňky a regulovat tak imunitní odpověď organismu. Jsou rozmístěny téměř ve všech
tkáních organismu (nejvíce v kůži). Pohlcují antigeny a následně migrují do sekundárních lymfatických
orgánů, kde zpracovaný antigen prezentují T buňkám, čímž je umožněn rozvoj účinné imunitní
odpovědi.
Žírné buňky (mastocyty)
Vyskytují se ve tkáních v oblasti tzv. imunologických bariér, tedy v místech, kde dochází ke kontaktu
vnitřního prostředí organismu s vnějším prostředím: v kůži, sliznicích na vstupu dýchacího a trávicího
traktu a v plicní tkáni. Podle místa výskytu se mohou mírně odlišovat ve své receptorové a
enzymatické výbavě, není to tedy zcela jednotná populace buněk. Hlavním receptorem žírných buněk
je vysokoafinní FcR a charakteristická jsou granula s obsahem histaminu, který je vyšší než u
bazofilů. Lidské mastocyty mívají různý tvar, kulovitý, vřetenovitý apod.
NK buňky
NK buňky mají jádra kulatá nebo se zářezem, obsahují azurofilní granula (lyzozomy) a morfologicky
představují přechodný typ mezi lymfocyty a makrofágy.
Endoteliální buňky
Patří k významným regulátorům imunitní odpovědi. Po aktivaci prozánětlivými cytokiny a regulátory
zánětu jako jsou tromboxany a leukotrieny výrazně zvyšují expresi adhezívních molekul. Tímto
způsobem může být zvýšen a topograficky cíleně směrován prostup imunitních buněk (neutrofilů,
monocytů a lymfocytů) do tkání. Samotné endoteliální buňky jsou zdrojem řady cytokinů, např. IL-1,
GM-CSF aj.
22
U ptáků, plazů, obojživelníků a ryb jsou erytrocyty a trombocyty oválné a s vyvinutým jádrem. U plazů
a ryb jsou obvykle širší než u ptáků. Počet erytrocytů je u jednotlivých druhů živočichů poměrně stálý.
U všech obratlovců nacházíme u samčího pohlaví zpravidla o 5 - 10 % více červených krvinek než u
pohlaví samičího. Ovšem procentuální zastoupení erytrocytů v krvi se velmi liší u různých tříd: u savců
je asi 45 %, u ptáků asi 35 %, a u některých ryb nebo obojživelníků jen kolem 20 %. Podobně je to i
s obsahem rozpuštěných látek v plazmě. Na vodu připadá v plazmě člověka 91 - 92 %, na rozpuštěné
látky 8 - 9 %. Na nižším fylogenetickém stupni je procento rozpuštěných látek nižší, např. u plazů a
ptáků kolem 4,5 %, obojživelníků asi 2,5 %.
U ryb, obojživelníků a plazů nebyly prokázány jednotlivé subpopulace T lymfocytů (Th, Tc) .
2.2 ROZDÍLY U MYŠI
U myší lze kromě normálních neutrofilů pozorovat také neutrofily s prstencovitým tvarem. Jejich počet
se zvyšuje při zvýšené granulopoéze (zvýšená tvorba granulocytů). Podobně i myší eosinofily mají
prstencová jádra. Nezralé formy neutrofilů ­ neutrofilní tyčky nejsou za fyziologického stavu
pozorovatelné v periferní krvi.
Krevní obraz: lymfocyty, monocyty, neturofily, eosinofily, basofily
Myší prstencovitý neutrofil
Degranulující myší eosinofil