2
1 Obecné laboratorní postupy
1.1 AUTOMATICKÉ PIPETY A ZÁSADY SPRÁVNÉHO POUŽÍVÁNÍ
Automatická pipeta slouží k manipulaci s řádově mikrolitrovými objemy zpravidla zředěných roztoků
(hustota přibližně okolo hustoty vody). Vzdáleně připomíná injekční stříkačku upravenou k manipulaci
s velmi malými objemy. Použití těchto pipet je možné jen s tzv. jednorázovými špičkami, které slouží
ke kontaktu s roztokem. Samotná pipeta by se NIKDY neměla dostat do přímého kontaktu
s pracovním roztokem. Automatické pipety jsou kalibrované na vylití, což znamená, že v pipetě
může zůstat minimální objem kapaliny. Nesnažte se jej za každou cenu z pipety dostat, hovoří se o
tzv. mrtvém objemu.
V praxi se běžně používají automatické pipety s rozsahem od 0,1 l po 5 000 l, přičemž obsahově
různé pipety se označují různými barvami:
- 0,1 ­ 10 l se označují bílým pruhem
- 5 ­ 200 l žlutým pruhem
- 100 ­ 1000 l modrým pruhem
Toto barevné označení usnadňuje také výběr špiček (jsou dostupné ve více objemech) a většina
špiček odpovídá svou barvou barevnému označení pipety. Při práci si musíme zvolit pipetu
s adekvátním rozsahem a špičku, která odpovídá obsahu pipety a která je schopna pojmout maximální
objem dané pipety.
Automatická pipeta se ovládá pomocí tlačítka pístu. Pro přesnou práci s automatickými
pipetami je třeba dodržovat následující zásady:
- automatické pipety se používají jen pokud je nasazená adekvátní plastová špička
- je-li ve špičce nějaká kapalina držte pipetu svisle, nepokládejte ji na stůl (kapalina by mohla
natéci dovnitř pipety a znehodnotila by ji)
- pohyb pístu musí být plynulý a pomalý, zvláště při práci s viskózními roztoky (s větší hustotou)
Píst (barva odpovídá objemu a špičce)
Tlačítko k pohodlnému odhození špičky jednou rukou (bez kontaktu)
Displej pro nastavení obejmu
Jednorázová špička
3
- při pipetování roztoků s vysokou viskozitou nebo povrchovým napětím nižším než má voda se
na vnitřní stěně špičky vytvoří vrstva roztoku. Při vypouštění tekutiny ze špičky tato vrstva
ulpívá na její vnitřní stěně a tak by mohla vzniknout chyba. Protože množství roztoku, který
ulpí ve špičce, je při opakovaném pipetování víceméně konstantní, je možné této chybě
zabránit tím, že se vrstva roztoku vytvoří ještě před vlastním pipetováním: do špičky se nasaje
roztok a vypustí se zpět do původní nádoby. Poté začneme vlastní pipetování. Všechna
následující pipetování pak budou mít stejnou přesnost a reproducibilitu
- pracovní roztoky je nutno vytemperovat na pokojovou teplotu. Při odměřování roztoků, jejichž
teplota se liší od teploty místnosti, se před vlastním pipetováním doporučuje špičku
opakovaně propláchnout roztokem (3-5x).
- špičku nasaďte na pipetu a dobře ji utěsněte mírným pootočením.
- špičku ponořte do přenášeného roztoku vždy jen na 2-3 mm a vyndávejte ji tažením po stěně
zkumavky, aby neadherovala nadbytečná kapalina.
- roztok vypouštějte po stěně zkumavky, nejlépe několik milimetrů nad hladinou
Pozn. Smočení špičky pipetovanou kapalinou před vlastním pipetováním zvyšuje přesnost pipetování,
ovšem většinou se vynechává kvůli úspoře času.
Vyvarujte se
- NIKDY nenasávejte tekutinu do pipety bez odpovídající špičky
- kapalina NESMÍ vtéci do pipety
- NIKDY neotáčejte pipetu špičkou vzhůru
- NIKDY nepokládejte na stůl pipetu se špičkou, ve které je kapalina nebo její zbytek
Postupy při pipetování
Výběr konkrétní pipetovací techniky závisí na typu práce a metody pro kterou ji vybíráme. Například
pro viskózní a pěnící roztoky nebo při práci s velmi malými objemy se používá technika obráceného
pipetování, neboť v těchto případech významně zvyšuje přesnost.
A) Přímá technika (forward pippeting)
Přímá technika je klasický a nejčastěji používaný způsob pipetování. Umožňuje rychlé a přesné
odměřování zředěných roztoků.
1. Stlačte píst pipety k první zarážce.
2. Ponořte špičku těsně pod hladinu (2 ­ 3 mm) odměřovaného roztoku a POMALU uvolněte
píst. Špička se naplní kapalinou. Počkejte asi jednu vteřinu a pak vytáhněte špičku z roztoku.
Buničinou nebo tamponem otřete kapičky roztoku, které ulpěly na zevní stěně špičky; při tom
se NESMÍTE DOTKNOUT ústí špičky.
3. Pod úhlem 10 ­ 45° p řiložte špičku ke stěně zkumavky, do které chcete přenést měřený
roztok. Jemně stlačte tlačítko pipety na první zarážku. Počkejte jednu vteřinu. Poté tlačte píst
pipety na doraz, čímž dosáhnete úplného vyprázdnění špičky (blow off). Za stálého držení
pístu vytáhněte špičku z roztoku.
4. Uvolněte tlačítko do výchozí polohy. Pokud je to nutné, vyměňte špičku a pokračujte v dalším
pipetování.
Znázornění postupu přímé techniky pipetování.
Výchozí pozice
2. zarážka
1. zarážka
1. 2. 3. 4.
4
B) Obrácená technika (Reverse pippeting)
Tato technika je vhodná pro pipetování roztoků s vysokou viskozitou nebo roztoků, které snadno tvoří
pěnu. Dále se tato technika doporučuje pro pipetování velmi malých objemů.
1. Stlačte píst až na druhý doraz.
2. Špičku ponořte těsně pod hladinu roztoku (2 ­ 3 mm) a pomalu uvolněte tlačítko. Špička se
naplní tekutinou.
3. Pomalu stlačte píst na první doraz a tím vypusťte přesný objem roztoku ze špičky. Zbytek
roztoku zůstává ve špičce, ten ale není součástí měřeného objemu, vyhodí se se špičkou,
případně se vrátí zpět do původní nádoby.
Znázornění postupu obrácené techniky pipetování.
C) Opakovací technika (Repeat pippeting)
Jedná se o rychlý a jednoduchý způsob opakovaného odměřování stejného objemu téhož roztoku.
1. Stlačte píst až na druhý doraz.
2. Špičku ponořte těsně pod hladinu roztoku (2 ­ 3 mm) a pomalu uvolněte tlačítko. Špička se
naplní tekutinou. Tuto tekutinu vypusťte a špičku naplňte znovu ­ tímto dojde ke smáčení stěn
vnitřního povrchu špičky a všechny další pipetování budou mít stejnou chybu.
3. Pomalu stlačte píst na první doraz a tím vypusťte přesný objem roztoku ze špičky. Držte píst
stále na prvním dorazu. Ve špičce zůstává zbytek roztoku, ten ale není součástí měřeného
objemu.
4. Znovu ponořte špičku těsně pod hladinu původního roztoku a pomalu uvolněte tlačítko do
výchozí polohy. Špička se opět naplní roztokem.
5. Pokračujte v pipetování tak, že opakujete postup uvedený v bodech 3 a 4.
Znázornění postupu opakovací techniky pipetování.
D) Pipetování plné krve
Plná krev je velmi viskózní kapalina. Při jejím pipetování je lepší využít obrácenou techniku pipetování.
Pipetujeme-li plnou krev nesmáčíme špičku před vlastním pipetováním a pro náběr krve používáme
vždy čistou špičku. Při pipetování krve je nutné dbát opatrnosti a pipetovat pomalu, abychom se
vyhnuli mechanické hemolýze.
Obrácenou technikou
1. Stlačte píst až na druhý doraz ponořte špičku pod hladinu roztoku a pomalu uvolněte tlačítko
do výchozí pozice. Vyškejte 1 s než se hladina krve ve špičce ustálí.
2. Buničinou nebo tamponem otřete kapičky krve, které ulpěly na zevní stěně špičky; při tom se
nesmíte dotknout ústí špičky.
3. Přiložte konec špičky na vnitřní stěnu zkumavky nad hladinu přítomné kapaliny, zmáčkněte
tlačítko na první doraz, počkejte jednu vteřinu a uvolněte tlačítko do výchozí pozice.
4. Vyhoďte použitou špičku.
Výchozí pozice
1. zarážka
2. zarážka
1. 2. 3.
Výchozí pozice
1. zarážka
2. zarážka
1. 2. 3. 4.
5
Přímou technikou
1. Stlačte píst na první doraz, ponořte špičku pod hladinu a pomalu uvolněte tlačítko do výchozí
pozice.
2. Buničinou nebo tamponem otřete kapičky krve, které ulpěly na zevní stěně špičky; při tom se
nesmíte dotknout ústí špičky.
3. Stejně jako při použití přímé techniky vypusťte krev do zkumavky s reakční směsí (přiložte
konec špičky na vnitřní stěnu zkumavky, zmáčkněte tlačítko na první doraz, počkejte jednu
vteřinu a pak zcela vyprázdněte špičku zmáčknutím tlačítka až na druhý doraz). Uvolněte
tlačítko do výchozí pozice.
4. Nejméně třikrát propláchněte špičku reakční směsí: Stlačte tlačítko na první doraz a ponořte
špičku do reakční směsi s přidanou krví. Držte tlačítko na prvním dorazu a zkontrolujte, zda je
špička skutečně pod hladinou. Pomalu uvolněte tlačítko do výchozí pozice. Špičku nechejte
nadále ponořenou v reakční směsi s přidanou krví. Opět stlačte tlačítko na první doraz a
pomalu je uvolněte. Tento postup opakujte dokud vnitřní stěna špičky není zcela čistá.
5. Nakonec zmáčkněte tlačítko až na druhý doraz a tím špičku úplně vyprázdněte.
6. Vyhoďte použitou špičku.
1.2 ŘEDÍCÍ ŘADA
V praxi se často setkáme se situací, kdy potřebujeme výchozí vzorek zředit. Nejčastěji se
používá dvojnásobná ředící řada, při které snižujeme v dalším kroku obsah rozpuštěné látky na
polovinu. Výsledkem bývá sada několika zkumavek, kdy každá další zkumavka v řadě obsahuje roztok
o přesně poloviční koncentraci rozpuštěné látky než zkumavka předcházející. Abychom Vám ulehčili
manipulaci a výpočet takové ředící řady, ukážeme Vám jednoduchý postup, jak dosáhnout ředící řady
s dvojnásobným ředěním. Níže uvedený postup se hodí například pro přípravu kalibrační křivky, jako
je ředění standardu.
Postup přípravy ředící řady (příklad na obrázku):
1) Připravíme si dostatečný počet zkumavek, podle toho, kolik ředění budeme provádět.
2) Zjistíme, jaký výsledný objem každého ředění budeme potřebovat a kolik ředícího roztoku
budeme přidávat (do všech zkumavek stejně ­ kromě první, kde bude dvakrát tolik).
3) První zkumavka bude obsahovat dvojnásobný objem než ten, který budeme potřebovat.
Musíme počítat s tím, že určitý objem budeme přenášet do druhé zkumavky. Budeme-li tedy
potřebovat 1 ml každého ředění, připravíme 2 ml prvního ředění.
4) Přidáme ředící roztok do všech zkumavek.
5) Do první zkumavky v řadě přidáme vypočtený objem ředěného roztoku.
6) Důkladně promícháme.
7) Z první zkumavky odebereme stejný objem, jaký máme ředícího roztoku v již připravených
zkumavkách a přeneseme jej do druhé zkumavky.
8) Důkladně protřepeme.
9) Pokračujeme od bodu 7, a opakujeme do poslední zkumavky v řadě. V poslední zkumavce
budeme mít nakonec dvojnásobný objem, než ve všech předchozích.
2 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Množství ředícího roztoku (většinou destilovaná voda nebo fyziologický roztok)
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
100 l ředěného roztoku
6
Častým problémem je chybná interpretace ředění. Nejčastěji se ředění udává ve 2 formách: podílové
a násobné. Podílová formulace představuje počet dílů rozpuštěné látky ku celkovému počtu dílů
roztoku (tedy např. 1 : 100). Násobná se pak uvádí jako několikanásobné zředění (např.
10x ­ desetinásobné).
Podílové ředění
Máme-li zadáno ředění 1 : 100, pak nový roztok bude mít celkem 100 dílů, přičemž 1 díl (tedy 1
setina) bude představovat původní zásobní roztok. Máte-li tedy zředit sérum 1 : 100, pak vezmete
například 1 l séra a přidáte 99 l fyziologického roztoku. Množství zásobního roztoku záleží na Vámi
požadovaném výsledném objemu. Potřebujete-li tedy 500 l zředěného séra (1 : 100) pak vezmete
5 l séra a přidáte 495 l fyziologického roztoku.
Násobné ředění
Uvádí-li se v zadání, že zásobní roztok zředíte 10x, pak výsledkem je koncentrace, která musí být 10x
nižší než zásobního roztoku. Například máte k dispozici 1 ml zásobního roztoku NaCl o koncentraci
10 g/ml a máte jej zředit 10x. Vezmete tedy například 100 l zásobního roztoku a přidáte 900 l vody.
Ve 100 l zásobního roztoku byl rozpuštěn 1 g NaCl a tím, že jste roztok doplnili na 1 ml, získali jste
výsledný roztok 1 g/ml, tedy 10x zředěnější.
1.3 PŘÍPRAVA HEMATOLOGICKÝCH VZORKŮ
Analýza plazmy a krevního séra je běžnější než analýza plné krve. Důvodem je zřejmě jednodušší
manipulace s plazmou a sérem. Obě tekutiny jsou oproti plné krvi méně vizkózní, navíc odpadají
problémy se srážením krve. Základním rozdílem mezi krevním sérem a krevní plazmou je přítomnost
fibrinogenu v plazmě. Proto je třeba v plazmě zabránit přeměně fibrinogenu na fibrin přidáním
antikoagulačních přípravků (heparin, hirudin, EDTA, citrát sodný, aj.). Používaná antikoagulační
činidla jsou:
Heparin
Heparin se váže na antitrombin, čímž dochází k jeho aktivaci. Antitrombin pak následné inaktivuje
trombin a další proteázy zůčastněné ve srážení krve. Heparin se používá na přípravu plasmy a
stanovení biochemických a imunologických parametrů. Vzorek je nutno zpracovat do 2 hodin po
odběru. Používají se deriváty jako heparinát lithný (-Li), sodný (-Na) nebo amonný (-NH4).
Používá se v koncentraci 10 U/ml krve (máme-li zásobní roztok s 1000 U/ml dáváme 10 l heparinu
do 1 ml krve).
Jeho použití se nedoporučuje např. při stanovení oxidativního vzplanutí (zháší chemiluminiscenci), při
DNA studiích, kdy nemůže být vzorek zpracován do 6 hodin (inhibuje PCR).
EDTA (EthyleneDiamineTetraAcetic acid ­ etylentetraoctová kyselina)
Patří do rodiny chelátů a trvale váže 2 a 3 mocné ionty (např. Ca
2+
, Mg
2+
). Bez vápenatých iontů
nemůže probíhat koagulační kaskáda. Používá se k diagnostice hematologických parametrů jako je
např. krevní obraz. Vzorek je nutno zpracovat do 3 hodin po odběru. V moderní medicíně se používají
látky jako K3-EDTA, K2-EDTA.
Používá se v koncentraci 14,4 mg na 10 ml krve.
Citrát sodný
Působí podobně jako EDTA - váže vápenaté ionty, i když ne tak silně. Používá se k diagnostice
hematologických a koagulačních parametrů. Vzorky je nutno zpracovat do 2 hodin po odběru.
Používají se 2 koncentrace citrátu sodného: 3,2% (0,109 mol/l) a 3,8% (0,129 mol/l). S krví se míchá
v poměru 1 díl citrátu a 9 dílů krve. Je potřeba velmi přesně dávkovat.
V praxi odpovídá barevné značení odběrových zkumavek konkrétnímu typu použité antikoagulační
činidla. Každý výrobce však používá vlastní barevné značení.
7
Odběr periferní krve
Dezinfekce místa vpichu. Po dezinfekci je nutné kůži nechat oschnout jednak pro prevenci hemolýzy
vzorku, jednak pro odstranění pocitu pálení v místě odběru. Po dezinfekci je další kontakt s místem
odběru nepřijatelný! Odběr se provádí do zavřených (vakuovaných) nebo otevřených zkumavek. Dle
měřeného parametru předem zvolíme typ použitého antikoagulačního prostředku.
Je dobré předejít hemolýze vzorku, která vadí většině biochemických i hematologických vyšetření,
protože řada látek se dostává z erytrocytů do séra nebo plazmy. Někdy také zabarvení interferuje
s výstupem některých stanovení a znemožňuje přesný odečet měřené veličiny.
Hemolýzu může způsobit:
1. Znečištění jehly nebo pokožky stopami ještě tekutého dezinfekčního roztoku.
2. Použití nevhodného průměru jehly a následná násilné aspirace krve.
3. Odběr je proveden z okolí hematomu, zánětu nebo otoku.
4. Prudké vystřikování krve ze stříkačky do zkumavky.
5. Prudké třepání krve ve zkumavce nebo nešetrné zacházení.
6. Zmrznutí vzorku krve.
7. Prodloužení doby mezi odběrem a diagnostikou.
8. Použití nesprávné koncentrace protisrážlivého činidla.
Příprava krevního séra
Příprava krevního séra je velmi jednoduchá. Periferní krev opatrně odebereme do zkumavky, přičemž
pracujeme dostatečně rychle, aby se nám krev nesrážela již při manipulaci. Odběrovou zkumavku
necháme vysrážet 2 hodiny při pokojové teplotě nebo přes noc v lednici. Na závěr centrifugujeme
(2500 G; 15 ­ 30 minut), abychom oddělili krevní sraženinu od krevního séra.
Příprava krevní plazmy
Odebíráme do zkumavek již obsahujících protisrážlivou látku. Ihned po odběru je nutno opakovaným
jemným převracením krev ve zkumavce promísit, aby se krev promísila s antikoagulans a nedošlo
k jejímu srážení. Netřepeme, došlo by k hemolýze. Na závěr centrifugujeme (2500 G; 15 ­ 30 minut),
abychom oddělili buněčnou složku od krevní plazmy.
Odběr kapilární krve
Pro odběr zvolíme dobře prokrvené místo vpichu (bříško prstu, ušní boltec, ocásek). Při odběru z prstu
vpich vedeme z boku bříška prstu, kde je nejlépe prokrven. V případě špatného prokrvení místo
vpichu prohněteme odběrové místo, zahřejeme třením nebo ponoříme do teplé vody. Provedeme
dezinfekci místa vpichu. Po dezinfekci je nutné kůži nechat oschnout pro prevenci hemolýzy vzorku.
Provedeme vpich, první kapku otřeme a provádíme vlastní odběr, krev musí samovolně vytékat do
zvolených odběrových nádobek a nesmí se násilně vymačkávat. Vzorek je třeba po odběru dobře
promíchat jemným poklepáním. Provedeme dezinfekci místa vpichu a případně přelepíme náplastí
s polštářkem.
Při neotření první kapky krve dochází k naředění vzorku a ovlivnění výsledků. Při špatném prokrvení
krev samovolně nevytéká a nadměrným tlakem jsou výsledky zkresleny (příměs tkáňového moku). Je
tedy třeba brát ohled na možné ovlivnění měřených parametrů.
8
1.4 PŘÍPRAVA KREVNÍHO NÁTĚRU
Krevní nátěry se běžně provádí z periferní krve. Ke zhotovení krevního nátěru je třeba použít
chemicky čistá a dokonale odmaštěná podložní sklíčka. Chemicky se čistí například ponořením do
chromsírové směsi (1 díl 10% vodného roztoku dichromanu draselného a 1 díl koncentrované kyseliny
sírové) nebo detergenčního prostředku. Po důkladném opláchnutí tekoucí vodou se sklíčka ponoří do
96% ethanolu nebo směsi ethanol-ether. Sklíčka se osuší na vzduchu nebo v termostatu. Očištěná
skla bereme zásadně za hrany, nikoliv za plochy sklíček.
Dezinfekcí ošetříme odebíraný prst a sterilní jehlou provedeme mělký vpich. První kapku krve, která
se objeví po vpichu do bříška prstu setřeme sterilním tamponem. Druhou kapku již přeneseme na
jeden konec podložního skla. Druhým podložním sklem provedeme nátěr dle obrázku. Druhé podložní
sklo držíme pod úhlem 45 °a snažíme se o rovnom ěrný plynulý pohyb ke druhému konci podložního
skla (snadněji dosažitelné s podložním sklem se zabroušeným okrajem).
Zhotovený nátěr musí být rovnoměrný, homogenní a přiměřeně tenký. Nátěr musí mít dlouhé okraje
rovné a na konci přecházet do "ztracena", nejlépe 1 - 2 cm před koncem sklíčka, přičemž se obvykle
vytvoří několik cípů.
Hotový nátěr se nechá na vzduchu dobře zaschnout. Poté se barví většinou komerčními soupravami
(kity) například Leukodif (Lachema a.s.).
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Neutrofily
Lymfocyty
Monocyty
Eozinofily
Bazofily
9
Barvení krevních roztěrů (Panoptické barvení podle Pappenheima)
1. Celý roztěr ve vodorovné poloze na 3 minuty převrstvit May-Grünwaldovým barvivem. Po třech
minutách přidáme destilovanou vodu tak, aby se původní barvivo nesmylo a naředěné cca 1 : 2
dále působilo jednu minutu.
2. Barvivo slít a roztěr opláchnout vodou.
3. Roztěr převrstvit Giemsa-Romanowského barvivem. Toto barvivo musí být před barvením
čerstvě naředěné přibližně 1 : 9 (na 10 ml destilované vody 10 - 15 kapek barviva). Nechat
působit přibližně 15 minut.
4. Barvivo slít a důkladně opláchnout pod tekoucí vodou.
Někdy je vhodné před vlastním barvením provést fixaci, tedy šetrné usmrcení buněk, při kterém buňky
pevně přilnou ke sklíčku. Fixace se obvykle provádí ponořením suchého roztěru do metanolu na
několik sekund. Fixační činidlo je však obsaženo i v použitých barvivech, proto lze tento krok
vynechat.
Popsaný postup je nejvíce používaným způsobem barvení krevních roztěrů. Dává velice dobré
výsledky co se týče obarvení granul a jader krevních buněk. V poslední době je na trhu několik typů
tzv. souprav pro rychlé bavení, které jsou sice mnohem pohodlnější z hlediska vlastní manipulace i
časové úspory, výsledky barvení však jsou zpravidla o něco horší (např. granula nejsou tolik výrazná,
celkový odstín je našedlý apod.) Může tak snáze dojít k záměně např. neutrofilu za eozinofil apod. Ve
cvičeních budeme používat sadu pro rychlé barvení Leukodif.
Ve cvičeních se setkáme s barvící soupravou Leukodif (Pliva Lachema a.s.). Barvení sestává ze 4
kroků a každý krok je tvořen sérií (v tabulce uvedena v závorce) několika ponoření do patřičného
roztoku. Nátěr vždy ponoříme jen na dobu 1 sekundy do patřičného roztoku podle následujícího
předpisu:
1. Fixace v methanolu (5 x 1s)
2. Kyselé barvení v Eosinu Y (3 x 1s)
3. Zásadité barvení v Azuru II (5 x 1s)
4. Opláchnutí ve stabilizačním pufr (PBS)
Poté necháme usušit a hodnotíme.
Nejčastější chyby při přípravě krevních nátěrů jsou:
- Příliš mnoho krve > tlustý nátěr
- Příliš málo krve > krátký nátěr
- Příliš dlouhé vyčkávání od odběru > srážení krve a vytvoření podélných pruhů
- Špatně odmaštěná skla > skvrnitý nátěr
- Třesoucí se ruka > vroubkovaný nátěr
10
1.5 POČÍTÁNÍ V BŐRKEROVĚ KOMŮRCE
Mnohdy se setkáme se stanovením koncentrace buněk, které udává počet buněk na danou
objemovou jednotku. V dnešní době lze k počítání buněk využít drahé přístroje zvané country (např.
Coulter Counter) nebo průtokový cytometr, které jsou plně automatické. Ovšem pořizovací cena těchto
přístrojů je velmi vysoká a tak je manuální počítání buněk v počítací komůrce stále ještě docela
rozšířené.
Princip takového stanovení spočívá v mikroskopickém pozorování speciální komůrky, na kterou byla
nanesena buněčná suspenze. Komůrka slouží k ustálení objemu ve kterém buňky pozorujeme.
Nejvíce rozšířená je tzv. Bürkerova komůrka, která představuje speciálně upravené podložní sklo se
dvěma počítacími ploškami, oddělených zářezem. V každé počítací plošce je mikromřížka o přesně
definovaných rozměrech:
Hloubka: 0,1 mm
Plocha malého čtverce: 1/400 mm
2
Plocha velkého čtverce: 1/25 mm
2
Postup počítání v Bürkerově komůrce:
1. Na čistou a suchou Bőrkerovu komůrku položte krycí sklíčko tak, aby těsně přiléhalo
k ploškám po stranách (využijte navlhčení styčných ploch)
2. Připravenou suspenzi buněk dobře protřepejte.
3. Naneste cca 10 l buněčné suspenze ze strany na hranu krycího skla (do obou počítacích
mřížek. Snažíme se vyvarovat tvorbě bublin.
4. Sledujte ve světelném mikroskopu. Používá se středním zvětšení (100x) s přicloněným
kondenzorem (přivřená aperturní clona kondenzoru). Postupujte vždy čtverec po čtverci
směrem zleva doprava a zhora dolů.
5. Po ukončení počítání obě části komůrky oddělte, opatrně opláchněte vodou a vytřete
dosucha.
Hodnocení
Počet buněk v 1 mm
3
(l) suspenze lze určit vzorcem: z
hvc
n
b *
**
=
b... počet buněk v 1 mm
3
n... celkový počet napočítaných buněk
c... počet čtverců ve kterých se počítalo (nejčastěji 25 nebo 50)
v... plocha použitého čtverce (malý nebo velký)
h... hloubka komůrky
z... použité ředění suspenze (uvádí se kolikrát byla suspenze ředěna např. 20x, tedy 20)
Hodnoty v a h jsou konstanty dohromady udávající objem čtverce, ve kterém se počítalo.
Každý vzorek spočítejte nejméně 25 čtverců v každé z počítacích mřížek (celkem tedy 50
velkých čtverců). Následující tabulku můžete použít jako podklad pro počítání buněk.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Horní komůrka
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Dolní komůrka
Poznámky:
- aby se nepočítaly buňky ležící na rozhraní sousedních čtverců dvakrát, počítáme jen ty, které leží
nebo se dotýkají pouze 2 vybraných sousedních stran čtverce (např. horní a levé, zevnitř i zvenčí).
- příliš hustou suspenzi je třeba dodatečně zředit, tak aby v jednom čtverci nebylo více než 10 buněk.
11
- leukocyty se počítají ve velkých čtvercích.
- Při počítání leukocytů se používá Türkův roztok (20 l krve + 180 l Türkova roztoku)
Spočítáme-li objem nad 50 čtverci komůrky při ředění 10x obdržíme koncentraci leukocytů v krvi tak,
že součet leukocytů vydělíme 5ti a výslednou hodnotu vyjádříme v 10
9
/l
Popis Bürkerovy komůrky
Zobrazení počítací mřížky (okraje jsou tvořeny ze 3 čar, aby byl zřetelný konec mřížky)
Postup vybírání čtverců Výběr buněk uvnitř 1 čtverce (černě označené se počítají, bílé ne)
12
1.6 CENTRIFUGACE
Centrifugace je metoda sloužící k oddělení látek, které mají odlišnou hustotu. Princip této metody
spočívá v odstředivé síle a ve výsledku dochází k rozdělení homogenní směsi v zásadě na 2 frakce:
supernatant (vrchní kapalná frakce) a pelet (neboli sediment, což je spodní frakce nerozpustných
částic). V imunologii se centrifugace používá např. při přípravě krevní plasmy nebo séra, oddělení
aglutinátu od ostatních složek, práci s buněčnými suspenzemi apod. Jinou možností použití je tzv.
frakční centrifugace, kdy se složky směsi rozdělují na základě velikosti a hustoty, např. separace
buněčných organel.
Exitují 2 základní typy centrifug: nízkorychlostní centrifugy, které patří mezi bězné vybavení a pracují
do 6 000 otáček za minutu a centrifugy nad 10 000 otáček se označují jako ultracentrifugy, které jsou
standardně vybaveny chlazením.
V praxi se v běžných laboratořích setkáme s tzv. mikrocentrifugami, což jsou nízkootáčkové
centrifugy, které jsou schopny měnit rychlost otáčení velmi rychle.
Parametry centrifugace jsou:
počet otáček za minutu (rpm ­ revolutions per minute; rounds per minutes)
odstředivá síla (g) která se vyjadřuje jako relativní odstředivé zrychlení RCF (relative centrifugal force)
a udává, kolikrát je zrychlení centrifugy vetší než tíhové zrychlení g = 9.81 m/s.
Vztah pro přepočet těchto jednotek je:
g = 0,0001118 x r x rpm
2
kde r je poloměr rotoru v cm
RCF je vhodnější pro popis parametrů centrifugace. Pokud bychom uvedli pouze počet otáček,
musíme mít i údaj o poloměru rotoru. Stejný počet otáček v centifugách o různém poloměru
rotoru nedává stejnou odstředivou sílu!
Příklad: Centrifugace vzorku při 3 000 rpm v centrifuze o poloměru rotoru 20 cm, odpovídá 2012 g.
V popisech laboratorních metodik se často setkáváme s tím, že údaje o centrifugaci nejsou dány zcela
přesně, např. je uvedeno: vzorky centrifugujeme 3 minuty při vysokých otáčkách. V některých
případech tyto údaje stačí, např. když chceme oddělit zákal z roztoku, není na závadu, když
centrifugujeme o několik minut déle. Naopak při manipulacích s buňkami musíme odstředivou sílu i
časy přesně dodržovat, aby se buňky nepoškodily a byly životaschopné (200 ­ 400 g). To platí i při
práci s krví, při přípravě séra nebo plasmy, kde se pohybuje v RCF 1000 ­ 3000 g.
Při práci s centrifugami dbáme především na vyvážení rotoru. Znamená to, že do protilehlých objímek
rotoru vložíme stejné zkumavky o stejné hmotnosti. Centrifugujeme-li lichý počet vzorků, na vyvážení
použijeme zkumavku s destilovanou vodou o stejném objemu jako protilehlá zkumavka.
! Rotor centrifugy musí být před začátkem separace vyvážen !
Centrifugace lze využít také v případě drahých nebo vzácných vzorků, kdy se snažíme zužitkovat
každý mikrolitr roztoku. Jakmile odebereme veškerý obsah zkumavky, zcentrifugujeme tuto na pár
sekund, třeba i při nízkých otáčkách, čímž se dostane roztok ze stěn zkumavek na její dno a získáme
tak pár mikrolitrů navíc.
13
1.6.1 Normogram pro přepočet parametrů centrifugace
14
Obecné principy spektrofotometrie
Každý prvek či molekula má schopnost pohlcovat (absorbovat) světlo (elektromagnetické záření).
Absorpcí určitého kvanta záření o určité vlnové délce a intenzitě přivede částici do tzv. excitovaného
stavu. Tento stav je charakteristický nestabilitou a částice mají tendenci vracet se do původního stavu
vyzářením nadbytečné energie opět v podobě elektromagnetického záření.
Různé částice jsou schopny absorbovat záření jen o určitých vlnových délkách. Vzdálenosti
energetických hladin před a po absorbování energie přímo určuje vlnovou délku elektromagnetického
záření, které je částice schopna pohltit. Energeticky nejnáročnější jsou přechody elektronů mezi
energetickými hladinami a jsou vyvolány absorbcí určitého kvanta ultrafialového (UV: 190 ­ 380 nm)
nebo viditelného světla (VIS: 380 ­ 780 nm). S látkami, které vnímáme jako viditelné světlo se
setkáváme každý den ­ jsou to všechny látky, které vnímáme jako barevné. Sluneční záření se skládá
ze všech vlnových délek viditelného světla a při absorpci některé z nich dochází k rozkladu barev, což
my vnímáme jako barvu.
Ke kvantifikaci pohlceného záření slouží přístroje zvané absorpční spektrometry (spektrofotometry).
Tyto přístroje zjišťují změnu v intenzitě elektromagnetického záření (světla), ke které došlo při
průchodu vzorkem. Jako vzorek se používá roztok obsahující rozpuštěnou látku, která je schopna
absorbovat záření určité vlnové délky. Procentuální vyjádření pohlceného záření označujeme jako
absorbanci (A). V praxi to pak vypadá tak, že v roztoku rozpustíme měřenou látku, jejíž přítomností
nebo aktivitou dochází ke změně absorpčních vlastností celého roztoku. Pomocí spektrometru
změříme množství světla, které tento vzorek pohltil a zároveň změříme množství pohlceného světla
čistým rozpouštědlem. Porovnáním těchto hodnot jsme schopni určit vlastní absorbci rozpuštěné látky
ve vzorku.
Absrobance při určité vlnové délce závisí na koncentraci (c) a na mohutnosti vrstvy (l) měřeného
vzorku. Vztah mezi výše uvedenými veličinami lze vyjádřit pomocí Lambert-Beerova zákona:
A = lc
 ­ molární absorbční koeficient představuje konstantu rozpouštědla.
Lambert-Beerův zákon platí pouze pro roztoky o nízkých koncentracích (10
-2
mol/l) a
nedá se použít u látek, které vykazují specifické interakce s prostředím
(fluorescence, luminiscence apod.). V naprosté většině případů však tento zákon
můžeme použít a představuje základní postup pro zjištění koncentrace látky
v roztoku.
Základním ověřením platnosti Lambert-Beerova zákona a zároveň metodologickým
základem je sestavení grafické závislosti absorbance roztoku na jeho koncentraci.
Tato závislost by měla být přímá, lineární a měla by nám poskytovat nástroj pro
stanovení neznáme koncentrace našeho vzorku (známe-li jeho absorbanci dosadíme
ji do grafu a odečteme koncentraci).
Schéma absorpčního spektrofotometru
Základní prvky absorpčního spektrofotometru jsou:
- zdroj záření
- monochromátor
- měřící komůrka
- detekční systém
Zdroj světla ve spektrofotometru musí mít vysokou intenzitu světla na všech vlnových délkách ve
viditelném spektru. Důvod je ten, že do detektoru se dostane jen zlomek z energie vyzářené
světelným zdrojem. Čím je intenzita světelného zdroje vyšší, tím více užitečného signálu dopadá na
detektor a užitečnou informaci lze lépe oddělit od šumu. Jako zdroj elektromagnetického záření pro
viditelnou oblast se u levných přístrojů využívá wolframová nebo halogenová žárovka, u drahých
potom pulzní xenonová výbojka.
Monochromátor je soustava prvků (hranol, reflexní mřížka apod.), které mají za úkol vytvořit na
výstupu monochromatický paprsek. Jinými slovy v něm dochází k výběru elektromagnetického záření
o přesně definované vlnové délce (např. 550 nm).
Měřící komůrka je prostor do kterého se umísťuje měřený vzorek. Starší přístroje využívali tzv.
kyvety, což byly speciální zkumavky čtvercového průřezu s objemem cca 1 ­ 1,5 ml. Současný trend
směřuje k minimalizaci objemu vzorku a kyvety byly nahrazeny moderními mikrodestičkami. Dnes jsou
k dispozici destičky s 96-, 384- až třeba 9600 jamkami (nejpoužívanější jsou 96ti jamkové).
Vlnová délka
625 až 740 nm
590 až 625 nm
565 až 590 nm
520 až 565 nm
500 až 520 nm
430 až 500 nm
380 až 430 nm
15
Detekční systém sestává z vlastního detektoru elektromagnetického záření a dalších zařízení na
postdetekční zpracování signálu. Detektor převádí zářivý tok na elektrický signál, který je dále
postdetekčně zesílen fotonásobiči a nakonec zobrazen na displeji.
16
1.7 HODNOCENÍ LABORATORNÍCH METOD Z HLEDISKA
PŘESNOSTI, CITLIVOSTI A SPRÁVNOSTI
Při hodnocení laboratorních metod v jakémkoli specifickém oboru se často hovoří o jejich citlivosti,
přesnosti a správnosti. Pro pochopeni těchto pojmů si znázorníme několik možných variant výsledků
měření na následujících obrázcích. Ve středu osového kříže leží správná hodnota měřené veličiny,
jednotlivá X představují realně naměřené hodnoty této veličiny.
1 - metoda je správná, ale nepřesná 2 - metoda je nesprávná ale přesná
3 - metoda je správná a přesná 4 - metoda je nesprávná a nepřesná
O přesnosti metody nás informuje směrodatná odchylka (s, SD ­ standard deviation).
Zda je použitá metoda správná můžeme posoudit jedině porovnáním se známými standardy nebo
srovnáním výsledku získaných několika různými metodami. První způsob je použitelný u metod
certifikovaných, kde pravidelná kontrola a srovnávání se standardy je součástí správné laboratorní
praxe. Druhý způsob je časově i finančně nákladný a používá se spíše ve výzkumu např. při
modifikacích metodik nebo zavádění nových postupů. Srovnávání výsledků mezi jednotlivými
laboratořemi je v imunologii někdy problematické, zejména v oblasti výzkumu. Výsledky totiž často
pocházejí z různých typů vysoce specializovaných přístrojů, metodiky se mohou nepatrně lišit
v některé použité chemikálii, způsobu získávání vzorků, technických parametrů metodik např. časech
inkubace, teplotě apod. Někdy se používají tzv. vnitřní standardy, které si každá laboratoř
vypracovává pro svůj konkrétní sledovaný parametr a použitý přístroj.
Další často uváděný parametr citlivost vyjadřuje, jaké nejmenší množství analyzované látky je metoda
schopna zachytit. Citlivost se obvykle uvádí jako poměr, tedy údaj 1 : 1 000 znamená, že 1 g
sledované látky naředěný 999 g ředícího roztoku bude ještě dávat pozitivní, detekovatelnou reakci na
daném typu přístroje. V tomto případě má metoda citlivost 10
-3
.
X X
X X
X X
X X
X X
X X
X X
X
X
1
2
3
4
17
1.8 ZÁSADY SPRÁVNÉ LABORATORNÍ PRAXE VE CVIČENÍ Z IMUNOLOGIE
1) Před samotným započetím práce si prostudujte návod a nachystejte potřebné věci (např.
zkumavky do stojánků apod.).
2) Všechny potřebné roztoky temperujte na pracovní teplotu. Není-li uvedeno jinak, vytemperujte
na laboratorní teplotu 20 ­ 25 °C.
3) S reagenciemi, zvláště pak s biologickým materiálem (např. krev) pracujeme zásadně na
filtračním papíře, abychom měli přehled o znečištění okolí. Na tento papír naopak
NEPOKLÁDÁME sešity, tužky a jiné věci podobného charakteru.
4) Automatické pipety nikdy NEPOKLÁDÁME na stůl, vždy do stojánku. Mohlo by dojít
k natečení zbytku kapaliny dovnitř pipety a znečištění následných pipetovaných roztoků.
5) Po přidání reagencie do zkumavky s nějakým obsahem VŽDY následuje promíchání, buď na
elektrické třepačce nebo pomocí pipety, kterou jsme právě použili (opakovaným nasátím a
vypuštěním promíchaného obsahu zkumavky).
6) Při pipetování řady vzorků stejného složení, ale různé koncentrace lze použít stejnou špičku
(pokud se její povrch nesmočí, což poznáme podle kapiček které zůstávají uvnitř či na
povrchu). V tom případě začínáme pipetovat nejméně koncentrovaný vzorek a postupně
přecházíme k vyšším koncentracím. Po napipetování vzorku do zkumavky se vždy
přesvědčíme, zda nám část pipetovaného objemu nezůstala ve špičce. V tom případě
použijeme novou špičku.
7) Použité a již nepotřebné špičky na pipety či plastové zkumavky odkládáme do speciálních
kontejnerů určených pro biologický odpad. NEVYHAZUJÍ se do koše na odpadky.
1.9 PRÁCE S POTENCIÁLNĚ NEBEZPEČNÝM BIOLOGICKÝM MATERIÁLEM
Práci s potencionálně nebezpečným biologickým materiálem upravuje zákon č. 258/2000 Sb.
Rizika
Krev i jiné druhy biologického materiálu mohou být vehikulem přenosu významných, potenciálně život
ohrožujících infekčních nemocí jako např. virová hepatitida B a C nebo HIV infekce. Po kontaminaci
místa narušeného kožního krytu nebo sliznice biologickým materiálem je nutno postižené osoby
sledovat a kontrolovat výskyt příznaků rizikového onemocnění.
Po rizikovém kontaktu s osobou nakaženou virovou hepatididou A je třeba monitorovat např. hladinu
anti-HAV ohrožené osoby po dobu 2 měsíců nebo IgM po dobu 6 měsíců. Při kontaktu s HIV se
sledují hladiny anti-HIV 1, 2 v období 43 ­ 56 dní.
V prevenci profesionální nákazy je po kontaminaci biologickým materiálem v závislosti na míře rizika
infekce navíc u zdravotnických pracovníků možná postexpoziční aplikace normálního lidského
imunoglobulinu v prevenci virové hepatitidy A a specifického imunoglobulinu (Hepatec) proti virové
hepatitidě B. U obou těchto nemocí je možná i prevence aktivní imunizací. V případě kontaminace
biologickým materiálem s obsahem viru HIV se doporučuje co nejrychlejší zahájení postexpoziční
chemoprofylaxe užíváním kombinace antiretrovirových léků.
Úplně prvním krokem při kontaminaci biologickým materiálem, ať už s poraněním nebo bez
něho, je místo dobře umýt vodou a mýdlem a aplikovat antiseptický virucidní prostředek (např.
roztok Braunolu, Softaseptu, Cutaseptu apod.).
Zacházení s biologickým materiálem
K odběru biologického materiálu se používají pouze sterilní nástroje, sterilní pomůcky a jednorázové
rukavice a to vždy pro každou ošetřovanou osobu. Rukavice musí splňovat technické požadavky na
osobní ochranné prostředky, prostupnost musí odpovídat jejich použití a míře rizika biologických
činitelů, jejich síla nesmí výrazně omezit citlivost rukou. Správný odběr biologického materiálu musí
být proveden ,,lege artis" a za aseptických podmínek. Odběry lze provádět pouze na ploše vyčleněné
pro odběr. Po odběru je třeba řádně ošetřit místo odběru. Odběrová nádoba musí být jednoznačně
označena tak, aby nemohlo dojít k její záměně a musí být zajištěna tak, aby nemohlo dojít ke
kontaminaci obsahu z okolí, ani okolí obsahem.
S biologickým materiálem je při transportu nutno nakládat jako s infekčním materiálem! Vzorky musí
být dokonale zabalené, většinou ve dvojitých obalech (ochranný a dekontaminovatelný transportní
obal), aby nedošlo k poškození nebo rozbití.