65
ÚLOHA 7: Dvojitá radiální imunodifúze podle Ouchterlonyho
Princip
Ouchterlonyho modifikace imunodifúze probíhá na skleněné destičce v agarózovém gelu, do kterého
se vysekají jamky podle šablony. Do jamek se pak nanáší Ag a Ab. Ty difundují radiálně do gelu a
v místě střetu vytvářejí charakteristické precipitační linie, které lze vizualizovat obarvením (např.
barvení bílkovin amidočerní). Podle jejich počtu lze stanovit počet přítomných dvojic Ag a Ab. Když
kolem jedné jamky s Ab vysekáme podle různých šablon několik jamek a do nich napipetujeme různé
Ag, můžeme podle tvaru obloučků a jejich propojení určovat identitu, příbuznost nebo odlišnost Ag.
Lze také porovnávat vzájemnou molekulovou hmotnost Ag a Ab.
Protože Ag a Ab difundují kolem jamek radiálně, nazývá se tato metoda dvojitá radiální imunodifúze.
Výhody a nevýhody
Metoda je snadná na provedení a výsledky jsou dobře patrné. Nevýhodou je dlouhá čekací doba na
vyhodnocení výsledků.
Chemikálie a roztoky
1. Antigen - Komerční lidské sérum obsahující známé množství IgG (Orion Diagnostica)
2. Protilátka - Komerční prasečí sérum s anti-IgG protilátkami (Orion Diagnostica)
3. Fyziologický roztok
0,85 g NaCl + 100 ml dH2O
4. Agaróza v práškové formě
5. Borát-fosfátový pufr (pH 6,8)
25,99 g H3BO3 + 2,4 g NaOH + 2,04 g KH2PO4 + 1 000 ml dH2O
6. Barvící roztok
225 ml CH3OH + 25 ml CH3COOH + 0,25 g amidočerni 10B
7. Odbarvovací diferenciační roztok
CH3OH : CH3COOH - 10:1
Vzorek: Komerční lidské sérum obsahující neznámé množství IgG.
Přístroje a pomůcky
Skleněné plotny 5 x 5 cm, skleněná pipeta, korkovrt napojený na vývěvu, Petriho misky na vlhkou
komůrku, filtrační papír, vyvažovací podložka pro nalévání skleněných ploten, vodováha, vařič, vodní
lázeň.
Postup (vlastní práce)
1. Připravíme skleněné plotny s agarózovým gelem:
a. vyvážíme podložku na nalévání do vodorovné polohy
b. skleněnou plotnu (5 x 5 cm) očistíme alkoholem a necháme oschnout
c. připravenou skleněnou pipetu několikrát propláchneme horkou vodou
d. na plotnu naneseme skleněnou pipetou 2,4 ml 1% roztoku agarózy v borát-fosfátovém pufru
e. gel necháme několik minut zatuhnout na kalibrované vodorovné ploše.
66
2. Připravíme si různá ředění séra se známým množstvím IgG pro kalibraci:
a) do zkumavky 1. napipetujeme 2 l séra a 18 l fyziologického roztoku
b) do zkumavek 2. a 3. napipetujeme 10 l fyziologického roztoku
c) ze zkumavky 1. přeneseme 10 l do zkumavky 2., zamícháme a přeneseme 10 l do
zkumavky 3. a opět zamícháme:
Označení zkumavky 1. 2. 3.
Fyziologický roztok 18 l 10 l 10 l
Antigen (sérum) 2 l - Ředění:
10x 20x 40x
Celkový objem: 10 l 10 l 20 l
3. Do gelu podle šablony vysekáme 5 jamek.
4. Do jamek naneseme:
a) do prostřední jamky 30 l antiséra
b) do tří okolních jamek 10 l různých ředění séra s IgG
c) do čtvrté jamky 10 l fyziologického roztoku
Dále pokračuje vyučující
5. Skleněnou plotnu vložíme do vlhké komůrky
a necháme inkubovat v lednici 48 hodin.
6. Po skončení inkubace pereme skla nejvýše 2 minuty
ve fyziologickém roztoku, zabalíme je do filtračního
papíru navlhčeného fyziologickým roztokem a přes noc
sušíme při pokojové teplotě.
7. V dalším cvičení sejmeme ze sklíček papír, skla opereme pod tekoucí vodou a barvíme barvícím
roztokem do dostatečného obarvení linií. Pozadí odbarvíme diferenciačním roztokem. Nakonec
opereme v destilované vodě a usušíme bez papíru.
Hodnocení
Vizuálně vyhodnotíme výsledek:
a) mezi jamkou s protilátkou (antisérem) a jamkou s fyziologickým roztokem by se neměla objevit
žádná precipitační linie
b) mezi jamkami s antigeny (různými ředěními séra) a jamkou s protilátkou (antisérem) by se měly
vytvořit různě ostré precipitační linie v závislosti na různém ředění
c) pokud se vytvoří ostrá precipitační linie, která se nerozmývá na žádnou stranu, došlo k vyrovnání
koncentrací IgG a anti-IgG
Výstup
Do protokolu uveďte:
1) Oskenovaný obrázek sklíčka s precipitačními liniemi (dodá vyučující).
2) Shrnutí, zda a jak se projevil rozdíl koncentrace séra s IgG a antiséra a jestli při některém ředění
bylo dosaženo stejné koncentrace IgG a anti-IgG.
10 l 10 l
3.
2.
1.
fyz. r.
anti-
IgG