ÚLOHA 9: Raketová elektroimunodifuze podle Laurella
Princip
Zkoumaný antigen je stejnosměrným elektrickým proudem unášen po gelu s protilátkou. Vazbou
antigenu a protilátky vznikají imunokomplexy, které se projeví jako precipitát v podobě tzv. raket.
Podstatou techniky je putování antigenu a tvorba imunokomplexů až do vzdálenosti, ve které je
veškerý antigen ze vzorku vyvázán protilátkou v gelu. Jde o jednu z nejpřesnějších kvantitativních
elektroimunodifuzních metod.
Výhody a nevýhody
Metoda je poměrně přesná a jednoduchá na provedení. Vyžaduje však nákladné přístrojové vybavení.
Je také nutné počítat s nejméně hodinovou rezervou při elektroforetické fázi a vyhodnocení výsledku
je možné až po určité době.
Chemikálie a roztoky
1. Komerční lidské sérum obsahující IgM pro kalibraci (Orion Diagnostica)
Obsah IgM je 2 g/l.
2. Protilátka - sérum s anti-IgM protilátkami
3. Fyziologický roztok
0,85 g NaCl + 100 ml dH2O
4. Agaróza v práškové formě
5. Borát-fosfátový pufr (pH 6,8)
25,99 g H3BO3 + 2,4 g NaOH + 2,04 g KH2PO4 + 1000 ml dH2O
6. Roztok Coomassie blue - malé množství rozpuštěné v dH2O
Nemusí být přesné množství, slouží pouze pro informaci o průběhu elektroforézy.
7. Barvící roztok
225 ml CH3OH + 25 ml CH3COOH + 0,25 g amidočerni 10B
8. Odbarvovací diferenciační roztok
CH3OH : CH3COOH - 10:1
Vzorek: Komerční lidské sérum obsahující neznámé množství IgM (Orion Diagnostica)
Vystupuje jako antigen.
Přístroje a pomůcky
Skleněné plotny 5x5 cm, skleněná pipeta, korkovrt na vysekávání jamek, vývěva, zdroj napětí,
elektroforetické komory, Petriho misky na vlhkou komůrku, filtrační papír.
Postup (vlastní práce) - pracujeme ve dvojicích
1. Ze zásobního komerčního séra o známé koncentraci IgM si připravíme další ředění.
a) do zkumavek 2. a 3. napipetujeme 10 l fyziologického roztoku
b) do zkumavky 1. napipetujeme 20 l séra se známou koncentrací IgM
c) ze zkumavky 1. přenášíme 10 l do zkumavky 2., důkladně promícháme a přeneseme 10 l
do zkumavky 3.
d) do další zkumavky si připravíme směs 10 l ze zkumavky 3. a 5 l roztoku coomassie blue
Označení zkumavky 1. 2. 3. 4.
Coomasie Blue - - - 5 l
Fyziologický roztok - 10 l 10 l Antigen
(sérum) 20 l - - Ředění:
- 2x 4x Koncentrace
[g/l]:
Celkový objem: 10 l 10 l 10 l 15 l
2. Podle šablony vysekáme do gelu s protilátkou řadu pěti jamek. Do jamek naneseme:
a) do prvních tří jamek 5 l ze zkumavek 1.-3.
b) do čtvrté jamky 5 l séra o neznámé koncentraci
c) do páté jamky 5 l naředěného kontrolního séra smíchaného s roztokem coomassie blue.
3. Do elektroforetických komor nalijeme borát-fosfátový pufr, na hranici mezi katodou a anodou
položíme připravená sklíčka a ze dvou protilehlých stran (od katody a anody) přiložíme na kraj
gelu filtrační papír nasátý borát-fosfátovým pufrem za účelem vedení elektrického proudu.
4. Každou komoru obsahující tři sklíčka zakryjeme a zapojíme elektrický obvod tak, aby do každé
elektroforetické komory vedl proud o velikosti 60 mA (20 mA na sklíčko). Elektroforéza bude
probíhat cca 1 hodinu, přičemž její průběh budeme sledovat na séru označeném roztokem
coomassie blue.
5. Po skončení elektroforézy pereme skla nejvýše 2 minuty ve fyziologickém roztoku, zabalíme je do
chromatografického papíru navlhčeného fyziologickým roztokem a přes noc sušíme při pokojové
teplotě.
6. V dalším cvičení sejmeme ze sklíček papír, skla opereme pod tekoucí vodou a barvíme barvícím
roztokem do dostatečného obarvení linií. Pozadí odbarvíme diferenciačním roztokem. Nakonec
opereme v destilované vodě a usušíme bez papíru.
1 : 8 1 : 4 1 : 2 konc.
Ukázka raketové elektroimunodifuze
10 l 10 l 10 l
Hodnocení
Plocha raketky po odečtení startovací jamky je úměrná koncentraci antigenu. Pro zjednodušení je
možné změřit pouze výšku raketky od horního okraje startovací jamky.
Změřte výšku a šířku vzniklých precipitačních útvarů a vypočítejte jejich plochu.
Hodnoty plochy precipitačních útvarů (cm
2
) u prvních tří jamek vyneste do bodového grafu proti
hodnotám koncentrace séra v příslušné jamce a vyneste kalibrační křivku s rovnicí regrese a
hodnotou spolehlivosti
Hodnotu plochy precipitačního útvaru u čtvrté jamky (lidské sérum o neznáme koncentraci IgM)
dosaďte do rovnice regrese a vypočítejte koncentraci IgM.
Výstup
1) Tabulku s hodnotami plochy precipitačních útvarů různých koncentrací kontrolního séra a vzorku.
2) Kalibrační graf závislosti plochy precipitačních útvarů na koncentraci kontrolního séra s rovnicí
regrese a hodnotou spolehlivosti.
3) Výpočet koncentrace IgM ve vzorku lidského séra.
4) Oskenovaný obrázek sklíčka s precipitačními útvary (dodá vyučující).
-
+
1. 2. 3. sérum s
coomassie
blue
vzorek