ÚLOHA 8: Turbidimetrické stanovení celkových Ig Princip Tato metoda využívá změny konformace a optických vlastností ke kterým dochází při denaturaci proteinů. Tyto změny nastávájí při srážení frakce proteinů ze séra, která odpovídá imunoglobulinům, vhodnou chemikálií např. síranem zinečnatým. Výsledkem této reakce je vznik zákalu, který lze detokovat spektrofotometricky. Výhody a nevýhody Poměrně spolehlivá, jednoduchá a levná metoda, která vyžaduje pouze spektrofotometr s filtrem pro určitou vlnovou délku a příslušné kontrolní sérum. Chemikálie a roztoky 1. Komerční lidské sérum s koncentrací Ig 40 g/l (Orion Diagnostica) 2. Fyziologický roztok 0,85 g NaCl + 100 ml dH2O 3. Roztok síranu zinečnatého (pH 5,8) 208 mg ZnSO4.7H2O + 1000 ml dH2O Vzorek: Komerční lidské sérum s neznámým množstvím Ig (Orion Diagnostica). Přístroje a pomůcky Spektrofotometr pro viditelnou oblast schopný měřit při vlnové délce 590 nm. Postup 1. Ze zásobního komerčního séra o známé koncentraci Ig si připravíme řadu ředění pro kalibraci a) do 1. zkumavky napipetujeme 16 l fyziologického roztoku b) do 2.-4. zkumavky napipetujeme 10 l fyziologického roztoku c) do 1. zkumavky napipetujeme 4 l komerčního séra o známé koncentraci d) z 1. zkumavky přeneseme 10 l do 2. zkumavky, důkladně promícháme, poté přeneseme 10 l do 3. zkumavky, důkladně promícháme a přeneseme 10 l do 4. zkumavky Označení zkumavky 1. 2. 3. 4. Fyziologický roztok 16 l 10 l 10 l 16 l Vzorek - - - 4 l Antigen (sérum) 4 l - - Ředění: 5x 10x 20x - Koncentrace: Celkový objem: 10 l 10 l 20 l 20 l 2. Připravíme si 5x ředěný vzorek ze vzorku (séra o neznámé koncentraci Ig). a) do 5. zkumavky napipetujeme 16 l fyziologického roztoku b) přidáme 4 l séra s neznámým množstvím Ig a důkladně promícháme 10 l 10 l 3. Různé ředění zásobního séra a vzorku smícháme s roztokem síranu zinečnatého přímo na mikrotitrační destičce: a) do celého sloupečku na destičku napipetujeme 150 l roztoku síranu zinečnatého do každé jamky b) napipetujeme 2,5 l do patřičné jamky z každé stejně označené zkumavky a důkladně promícháme. Zkumavka 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1. B C 2. D E Kalibračka 3. F G 4. vzorek H st. 1 st. 2 st. 3 st. 4 st. 5 st. 6 st. 7 st. 8 st. 9 st. 10 st. 11 st. 12 Tab. 4. Rozvržení vzorků na společné destičce pro celou skupinu. Každý student bude mít 1 sloupec, což popisuje poslední řádek (zkratka st. = student). Vzorky se nanáší v duplikátech pod sebou. 4. Směs síranu zinečnatého a séra necháme kultivovat 2 hodiny při laboratorní teplotě. Provádí vyučující 5. Po uplynutí dané doby směs promícháme a změříme absorbanci při vlnové délce 590 nm na spektrofotometru. Hodnocení Výstupem je série hodnot v tabulce, ve které jsou uvedeny hodnoty absorbance pro každou jamku. Absorbance je bezrozměrná veličina, která udává množství pohlceného světla. S tabulkou lze pracovat v excelu nebo jiném tabulkovém programu. Každý si vybere jamky ze sloupce, který pipetoval a s těmito hodnotami dále pracuje. Zprůměrujte hodnoty duplikátů a získáte 3 hodnoty absorbancí pro sestavení kalibrační křivky a hodnotu pro vzorek. Vytvořte lineární kalibrační přímku se zobrazením rovnice regrese a hodnoty spolehlivosti. Pomocí této rovnice spočítejte koncentraci imunoglobulinů ve vzorku. Nezapomeňte operovat s patřičným ředěním. Výstup 1) Tabulka hodnot (koncentrace a absorbance) kalibračních sér a vzorku. Uveďte koncentraci imunoglobulinů v ředěném vzorku, ale i hodnotu Ig v původním neředěném vzorku. 2) Bodový graf s proloženou lineární regresní křivkou, hodnotou spolehlivosti R a rovnicí regrese ÚLOHA 9: Turbidimetrické stanovení celkových IgG Princip Určení lidského imunoglobulinu určité třídy je založeno na reakci mezi imunoglobuliny jako antigeny a specifickém antiséru jako protilátce, se kterou budou imunoglobuliny reagovat. Při této reakci vzniká nerozpustný imunokomplex antigen-protilátka tvořící zákal, který je měřen spektrofotometricky. Výhody a nevýhody Podobně jako u stanovení celkových Ig se jedná o dosti spolehlivou a jednoduchou metodu, která vyžaduje spektrofotometr s filtrem pro určitou vlnovou délku, kontrolní sérum o známé koncentraci IgG a příslušné antisérum. Chemikálie a roztoky 1. Komerční lidské sérum s koncentrací Ig 40 g/l (Orion Diagnostica) 2. Komerční prasečí antisérum s anti-IgG protilátkami (Orion Diagnostica) 3. Fyziologický roztok 0,85 g NaCl + 100 ml dH2O 4. Reakční pufr (0,05M Tris) 6,057 g C4H11NO3 + 1000 ml dH2O Vzorek: Komerční lidské sérum s neznámým množstvím Ig (Orion Diagnostica) Přístroje a pomůcky Spektrofotometr pro UV oblast schopný měřit při vlnové délce 340 nm. Postup 1. Ze zásobního komerčního séra o známé koncentraci IgG si připravíme řadu ředění pro kalibraci. a) do 1. zkumavky napipetujeme 20 l séra b) do 2.-3. zkumavky napipetujeme 10 l fyziologického roztoku c) z 1. zkumavky přeneseme 10 l do 2. zkumavky, důkladně promícháme, poté přeneseme 10 l d) do 3. zkumavky a důkladně promícháme. Označení zkumavky 1. 2. 3. Fyziologický roztok - 10 l 10 l Vzorek - - Antigen (sérum) 20 l - Ředění: - 2x 4x Koncentrace: Celkový objem: 10 l 10 l 20 l 10 l 10 l 2. Smícháme antigen (řada ředění séra o známé koncentraci IgG a vzorek) s protilátkou (antisérum s anti-IgG) a reakčním pufrem a) přímo na destičku napipetujeme napřed 2,5 l kalibračního séra nebo vzorku b) poté napipetujeme multikanálovou pipetou do každé jamky 25 l antiséra c) nakonec do včech jamek napipetujeme multikanálovou pipetou po 150 l reakčního pufru do každé jamky a pořádně promícháme špičkou. Zkumavka 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 1. B C 2. D E Kalibračka 3. F G 4. vzorek H st. 1 st. 2 st. 3 st. 4 st. 5 st. 6 st. 7 st. 8 st. 9 st. 10 st. 11 st. 12 Tab. 5. Rozvržení vzorků na společné destičce pro celou skupinu. Každý student bude mít 1 sloupec, což popisuje poslední řádek (zkratka st. = student). Vzorky se nanáší v duplikátech pod sebou. 3. Mikrotitrační destičku inkubujeme minimálně 10 minut při 37 °C, aby se stihly vytvořit imunokomplexy. 4. Po uplynutí dané doby ještě jednou promícháme a změříme absorbanci při vlnové délce 340 nm. Hodnocení Výstupem je série hodnot v tabulce, ve které jsou uvedeny hodnoty absorbance pro každou jamku. Absorbance je bezrozměrná veličina, která udává množství pohlceného světla. S tabulkou lze pracovat v excelu nebo jiném tabulkovém programu. Každý si vybere jamky ze sloupce, který pipetoval a s těmito hodnotami dále pracuje. Zprůměrujte hodnoty duplikátů a získáte 3 hodnoty absorbancí pro sestavení kalibrační křivky a hodnotu pro vzorek. Vytvořte lineární kalibrační přímku se zobrazením rovnice regrese a hodnoty spolehlivosti. Pomocí této rovnice spočítejte koncentraci imunoglobulinů ve vzorku. Výstup 1) Tabulka hodnot (koncentrace a absorbance) kalibračních sér a vzorku. Uveďte koncentraci imunoglobulinů v ředěném vzorku, ale i hodnotu Ig v původním neředěném vzorku. 2) Bodový graf s proloženou lineární regresní křivkou, hodnotou spolehlivosti R a rovnicí regrese