„ABC“ o ABC transportérech Aktivní a pasivní transport živin ABC transportéry a jejich detekce Fyziologická role Kmenové buňky a regenerace Nádorové bujení Multiléková rezistence Regulace exprese ABC transportérů Zdroj energie Transport přes membránu Typy aktivního transportu ABC transportéry l ATP-binding cassette l Za spotřeby ATP pumpují toxické látky/metabolické produkty VEN z buňky (výjimka CFTR) l Fyziologická funkce – sekrece látek produkovaných buňkou + obrana proti xenobiotikám Struktura Krystalografická struktura Filogenetický strom ABC transportérů Výskyt ABC transportérů Šipky označují výskyt a směr transportu Substráty ABC transportérů - výživa Syntéza antigenu 0 Dědičné choroby Detekce ABC transp. Calcein AM Calcein AM je substrátem MRP1, MDR1 Inhibitory - MK571, NSAID, cyclosporin D, reversin Kmenové buňky V průběhu diferenciace klesá exprese ABC transportérů ABC v kmenových buňkách MDR1/Pgp << MRP1 „SP“ buňky Buňky C2C12 - myoblasty Důkaz „kmenovosti“ Játra Rozhraní krev vs. Hepatocyty Regenerace – MDR + BCRP Regenerace ledvin BCRP Transporter Na+ Teorie vzniku metastáz Model klonální selekce Model paralelní evoluce nádoru Integrující model evoluce nádoru A normální kožní tkáň B primární nádor C subkutánní metastázy D metastázy v lymfatické uzlině E metastázy v plicích Nádorová kmenová buňka Strategie léčby MDR a rakovina l Selhání chemoterapie (nádorové b. jsou obvykle citlivější než „zdravé“ buňky) l De novo/získaný fenotyp MDR (cytotoxic in vitro MTT-assay) l Mechanizmy: – Změny v metabolických drahách, které se podílejí na detoxifikaci látek – Změny v reakci organizmu na poškození DNA – Změny v aktivitě topoizomerázy II – Změny v drahách regulujících apoptózu – Zvýšená produkce ABC transportérů l Nádorová b. se vymyká vlivu svého prostředí (obsahujícího chemoterapeutikum), získává „evoluční“ výhodu ! Různé substráty -> MULTIléková rezistence! ABC-B1 – MDR1; ABC-C1 – MRP1; ABC-G2 - BCRP Imunocytochemie ABC transportéry l Stres (teplo, zánět, hypoxie, UV záření, diferenciační činidla) vedou k zvýšení jejich exprese – enhacesom l Rychlé zvýšení exprese po inkubaci s jejich substráty (doxorubicin, vinca alkaloidy, etoposid, taxely) = jak zamezit zvýšení exprese dřív než nastane??? Studium signálních drah vedoucích k zvýšené expresi ABC transportérů ve stresových podmínkách – role p38 MAP kinázy MAPK Metody l Modelová buněčná linie – A549 epiteliální buňky NSCLC – mESC wt, mESC p38-/- – HL-60 transfektanti l Modelový treatment – IFNa (prozánětlivý cytokin, terapie CML, melanomů…, kombinace s imanitibem, cytarabinem) l Experimentální design l Dye exclussion assays (průtoková cytometrie) – MDR1: JC1 / Cyclosporin D – MRP1: Calcein AM / MK571 – BCRP: bodipy-prazosin, pheophorbid A / Fumitremorgin C l Exprese studovaných proteinů – Western blotting HL-60 transfektanti JC1(MDR1/CSD) Calcein AM (MRP1/MK571) Bodipy-prazosin (BCRP/Fumitremorgin C) Pheophorbid A IFNa způsobuje fosforylaci kinázy p38 Krejčová et al. 2009, General physiology and biophysics, in print A549 IFNa vede k zvýšení exprese ABC transportérů A549 IFNa snižuje funkčnost MRP1 a BCRP, inhibice p38 tento efekt zvrátí mESC Shrnutí l IFNa indukuje stabilní zvýšení aktivity p38 MAPK l IFNa vede k zvýšení exprese ABC transportérů l Inhibice p38 sníží expresi ABC transportérů l Mechanismus účinku p38 l Ostatní MAPK? Děkuji za pozornost