PREZENTACE MOŽNOSTI STUDIA NA ODDĚLENÍ FYZIOLOGIE A IMUNOLOGIE ŽIVOČICHŮ A. Kozubík ytokinotiky fliofyzikální úslov HVCR, ARNO Co by mělo být rozhodováno nejdřív: Proč chceme studovat, jaký je opravdový zájem? Naše možnosti Na základě čeho se rozhodujeme? Kdy začít a proč? Kde začít? Jaké máme možnosti uplatnění po skončení studia? ■ oboraloř ytokinetiky Biofyzikálni ústav miň, MHO Období zásadních organizačních změn Laboratoř Buněčné fyziologie a imunologie Laboratoře KSFZOZ - Doc. Dr. A. Kozubík, PhD. (Katedra srovnávací fyziologie živočichů a obecné zoologie) Buněčná fyziologie a imunologie ][ Fyziologie a imunologie hmyzu Neurobiologie a molekulární psychiatrie doc. RNDr. A. Kozubík, CSc. RNDr. M. Vácha, Ph.D. doc. RNDr. A. Žákovská, Ph.D. RNDr. O. Šery, Ph.D. doc. RNDr. J. Hofmanová, CSc. doc. RNDr. S. Kozubek, CSc. doc. RNDr. A. Lojek, CSc. Mgr. J. Procházková, Ph.D. RNDr. J.Vondráček, Ph.D. Mgr. K. Souček, Ph.D. Mgr. L. Kubala, Ph.D. RNDr. M. Číž, Ph.D. RNDr. E. Bártová, Ph.D. RNDr. M. Machala, CSc. RNDr. J. Turánek, CSc. doc. RNDr. V. Ptáček, CSc. RNDr. P. Hyršl, Ph.D. RNDr. E. Janouškovcová, Ph.D. R. Pitelová Mgr. J. Nejedlík Mgr. R. Štaif Prof. RNDr. V. Mikeš, CSc. Mgr. J. Lochman Fyziologie a imunologie hmyzu doc. RNDr. A. Kozubík, CSc. • mechanizmy účinku specifických exogenních a endogenních cytokinetických regulátorů (cytokiny, faktory výživy, karcinogény) na buněčný růst, diferenciaci a smrt, specifické interakce a přenos signálů těchto regulátorů • kinetika tvorby reaktivních kyslíkových a dusíkových radikálů za fyziologických i patologických podmínek • a detailní studie cytokinet. parameterů za použití metod průtokové cytometrie, mikroskopie (světelné, fluorescenční, konfokální) a pokročilých technik molekulární biologie • studium procesu karcinogeneze, prevence vzniku nádorů a optimalizace protinádorových terapií RNDr. M. Vácha, Ph.D. • mechanizmy obranné imunitní reakce u hmyzu vyvolané stresovými podmínkami (teplota, poranění, bakterie, chemikálie, invaze entomopatogeních hlístů) • srovnání humorální (lysozym) a buněčné (fagocytóza) imunitní odpovědi mezi bezobratlými (hmyz) a obratlovci (ryby), úloha reaktivních kyslíkových radikálů • fyziologie hmyzu, hemolymfa, dýchání, hormonální řízení vývoje hmyzu • foto- a magnetorecepce hmyzu, citlivost na světlo, kompasové orientační chování, zapojení mozkových struktur - Doc. Dr. A. Kozubík, PhD. jie živočichů a obecné zoologie) Lymská borelióza Neurobiologie a molekulární psychiatrie doc. RNDr. A. Žákovská, Ph. RNDr. O. Šery, Ph.D. • Lymská borelióza • přírodní zroje infekce limskou boreliózou v České republice • izolace druhů Borelia z hlodavců • identifikace izolovaných druhů Borrelia a jejich serologické potvrzení • relationship between DNA polymorphism of selected genes and psychiatric diseases (alcoholism, hyperactivity) • genetics of pain sensitivity • DNA detection of eye pathogens (viruses, bacteria, fungi) Laboratoře KSFŽQZ - Doc. Dr. A. Kozubík. PhD. (Katedra srovnávací fyziologie živočichů a obecné zoologie) Buněčná fyziologie a imunologie ][ Fyziologie a imunologie hmyzu | Lymská borelióza Neurobiologie a molekulární psychiatrie - University of Turku - Finland - Hebrew University of Jerusalem - Israel - National Institute of Traumatology - Hungary - Catholic University - Italy - Ústav exerimentální farmakologie-SR - Universita P. J. Šafárika, Košice- SR - Johannes Gutenberg University, Mainz - Germany - University of Kentucky -USA Česká republikr - Centrum kardiovaskulární a transplantační chirurgie, FN Brno - Fakultní nemocnice -Masarykův ústav, Brno - Konference a semináře České společnosti pro analytickou Cytometrii - University of Kiel - Germany - University of Turku - Finland -Institute for Plant Production, Piešťany - Slovakia - Virginia Tech University -USA Česka republika: - Ústav fyziologie, Ústav entomologie, AV ČR, České Budějovice - Česká sbírka mikroorganismů, Brno - Ústav organické chemie a biochemie, Praha - Výzkumný ústav krmiv, Troubsko Oddelení živočíšne fyziologie a imunologie Česká republika: Česká republika: J - Ustav psychiatrie, UK, Praha - Oddělení psychiatrie, FN, Brno - Ústav lékařské biochemie, UK, Praha - Oční klinika, FN, Brno Laboratories of DCAPGZ (Department of Comparative Animal Physiology and General Zoology) PERSPECTIVES Cellular Physiology and Immunology doc. RNDr. A. Kozubik, CSc. This novel research area is based on the long-term participation of team members in teaching within department. The program has high level of grant support enabling to enlist further students and staff in this prospective research area. Intensive international collaboration, as well as high publication activity ensures further successful development. Although these activities rely on external lecturers, a long term collaboration between Institute of Biophysics and the Department should guarantee further development of the Department. Insect physiology and Immunology Lyme disease ■ Neurobiology and Molecular Psychiatry RNDr. M. Vácha, Ph.D. doc. RNDr. A. Žákovská, Ph ^T RNDr. O. Šery, Ph.D. Traditional area -•available grant support; •good quality publications; Department of Animal Physiology and Immunology ZAMĚŘENI Skupina laboratoří Biofyzikálního ústavu Oddělení patofyziologie volných radikálů Skupina fyziologie a imunologie hmyzu Neuroetologie Apidologie Imunologie elení cytokinetiky i Zaměření - přenos signálů regulujících b. Dělení, diferenciaci a smrt buněk int. proliferujících populací sJSIádorové b.) fyziologie kmenových bune„ (V. Bryja, P. Krejčí, J. Pacherník, J. Procházková ) (J. Hofmanová, J. Vondráček, K. Souček, A. Vaculová « ' '' 'I ' •> /"ffr kŕ ,4H„ Uli«,, »6-WÍf rostory PrF MU v rekonstrukci) i oborciloř ytokinetiky Riofyzikälní ústav AVČR, ARNO Východiska ORGANISMUS JAKO KOMPLEXNÍ HIERARCHICKÝ SYSTÉM organismální, tkáňová bunečná molekulová Nelze oddělovat (naopak nutno usilovat) studium na jednotlivých úrovních organizace systému Obtížně realizovatelné v rámci jedné laboratoře TOXIKOLOGIE EKOTOXIKOLOGIE ■ cibercileř ytokinetiky niefyzihälnf ústav »VCR, ARNO experimentální základna REGULACE BUNĚČNÉ KINETIKY (PROLIFERACE, DIFERENCIACE A APOPTOZY) na úrovni 1 - molekulární 2 - buněčné 3 - systémové (organismus, populace, ekosystém) ONKOGENEZE fáze: 1 INICIAČNÍ PODPŮRNÁ (INITIATION) (PROMOTION) POPULACE NORMÁLNÍCH (NETRANSFORMOVANÝCH )BUNĚK „cell signalling (cytokiny a růstové modulátory vs. PUFAs a, L eikosanoidy) J klinická data, POPULACE TRANSFORMOVANÝCH BUNĚK PROGRESIVNÍ FÁZE (PROGRESSION)! ytokinetiky ftiofyzikolní úslov AVČR, BRNO Rovnováha (homeostáza) obecně výsledek působení mnohocetných zpětných vazeb ytokinetiky Biofyzikálni úslov AVČft, ARNO ciborcitoř ytokinetiky Biofyzikálni úslov AVČB, BAŇO FAKTORY SPECIFICKÉ + FAKTORY NESPECIFICKÉ vymezeni interakcí membrána cytosol ■ oborcili Vlokineliky ■kvilní úslov flVČn, ARNO Základní schéma signalizační kaskády ovlivňující průběh cytokinetiky růstové signály receptory ÄZÄUTC, molekuly signálové transdukce ytokinetiky ftiofyzikólní úslov AVČII, BRNO The four important families of small organic molecules in cells building blocks of the cell larger units of the cell |_ SUGARS_____| H ► 1 POLYSACCHARIDES | !__ FATTY ACIDS____j Sfl^ | FATS, LIPIDS, MEMBRANES! AMINO ACIDS PROTEINS NUCLEOTIDES NUCLEIC ACIDS Figure 2-17. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. strukturní úloha FOSFOLIPIDU V BUŇKÁCH íW -■'■- T*. - ■v i* BU (SfW lEMBRANOVE SYSTÉMY a buněčné kompartmenty protientropické důsledky Přirozené funkce membránových lipidu FUNKČNÍ TRUKTURN (REGULAČNÍ) ciborciloř ytokinetiky Riefyzikolnf Ostav ItVČA, BRNO MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS PLA, COOH I CYCLOOXYGENASES A. PGG EPOXYGENASES (P450) LTC, COOH LIPOXYGENASES COOH CH CO NH CH2 COOH NH COCH2CH2CHCOOH NH oboral ytokinetiky Biofyzikálne Ostav MVČft, BRNO Oncogenes Growth factor) fgf-5 sis hst int-2 Receptor bek fms erb B mas fkg ros Tyrosine kinase abl erb met B2/neu ret fes/fps sea fgr src trk fyn kit yes Ick G protein rab ras ral Serine kinase |_j mil/raf pks mos raf pim-1 rel Nuclear fos myc jun ski mvb______ Growth factor Receptor Transducer Effector 2nd messenger Target Úrovně interakcí schematicky Receptor« Receptor G protein « ReceptoL. i G protein ReceptoL i m ■Receptor_ PLCy tyrosine, kinase G protein ^ I > m PLA2___Na+/H-_ Adenyly Regulatory proteins RNA/protein synthesis DNA synthesis A DG IP3^[Ca21 y antiport cyclase donate I I Arachidonate /A PG TX IP"! CMfP^ ______ \ 1 o PKC~ PK(?) Calmodulin PKA i i i___Jl+ c o \— m According to: G.Powis: TiPS; 12: 188 -194, 1991 SIGNAL (např. cytokiny) Schematické znázornění úlohy vybraných složek fosfolipidového metabolismu v b. signalizacích inhibice (NSAID) n-6 PUFA (AA, LA) membránové fosfolipidy kyselina arachidonc Mimobuněčné podněty (cytokiny, hormony, polutanty, záření) o growth factors hormones O receptorl PLA AAAMAAA *WWWW I AA cyclooxygenases lipoxygenases CP450 monooxygenases 1 eicosanoids ■ion channel activity ■ guanylate cyclase ■ adenylate cyclase ■ protein kinase C ■ protein kinase A ■ tyrosine kinase ■ MAP kinase ■ G-proteins ~-*v transcription factors i gene expression cell growth Zjednodušené obecné schéma efektů i a jejích metabolitů According to: A. Sellmayer et al. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids ; 57:353-357,1997. ťl 4TT r zapojení fosfolipidových komponent v buněčných signalizacích CSF-1 tvr tyr-P receptor substrates e.g. PI-3 kinase G proteins (ras/GAP?) nucleus mRNA phospholi '' other effectors e.g. phospholipases kinase PKC Fluid-phase pinocytosis Glucose IŕF oborotor ytokinetiky Biofyzikálni ústov AVČR, ARNO aani prístup detekce hlavních parametrů (dynamiky) EKflE ziímm Tnsví I*tiJ differentiation proliferation apoptosis (necrosis) time (t) ytokinetiky ftiofyzikélní úslov AVČA, ARNO Modulation of signaling pathways I. Addition of exogenous arachidonic acid (AA) II. Modulation of eicosanoid production by inhibitors of: LPO or CO or P450 TGF-ß.,/ TNFcc TGF- p1 A ^ \ TNFa \ ^ TGF- ß.,/TNFa differentiation (+) after induction into: granulocytes or monocytes / macrophages differentiation apoptosis (necrosis) time (t) Collection of cytokinetic data MÍM*iailIiinísiKU[*]ÉM*niísltciÍI}Řl}r»]Í»slÍIé»sl*I*]»K*MKll Data analysis - specification of significant interactions detailed study of mechanisms ciborcitory ytokinetics Institute of Biophysics, ßrne I 0> C/5 = o ^M ft c/j o s o c« o o <*N • PN o WD O 0s o M Factor 2-concentration Factor 1 - concentration An example of interactions of two factors (data from Eur. J. Pharmacol. 316, 349-357, 1996, see Publications.) MODELY: Buňky tzv. intenzívně proliferujících populací (buňky nádorové) zejména b. krvetvorné, b. střevních epitelu a b. jaterní OBLASTI STUDIA a STUDOVANÉ LÁTKY oo^ Buňky epiteliálního původu code Lokalization Organisms Pahtology A2780 ovarium člověk karcinom, Pt - citlivé A2780cis ovarium člověk karcinom, Pt - rezistentní A549 plíce člověk karcinom BEAS-2B plíce člověk tranformované virem CaCo2 kolon člověk adenokarcinom CCL-64 plíce norek normální CH-1 ovarium člověk karcinom, Pt- citlivé COR-L23 plíce člověk karcinom COR-L23/CP3 plíce člověk karcinom, Pt - rezistentní COR-L23R plíce člověk karcinom, doxorubicin -rezistentní CT26 kolorectum myš karcinom E10 plieni myš normální FHC kolon člověk embryonální H4IIELUC játra krysa karcinom Buňky epiteliálního původu code Lokalization Organisms Pathology HaCaT epidermis člověk normální HeLa cervix člověk karcinom Hepal játra myš karcinom HepG2 játra člověk karcinom HT-29 kolon člověk adenokarcinom HT115 kolon člověk adenokarcinom HUVEC endotel člověk embryonální LEP plíce člověk embryonální (fibroblasty) MCF-7 prs člověk adenokarcinom 1 MDA-MB-231 prs člověk adenokarcinom MDCK ledvina pes normální MVLN prs člověk adenokarcinom SKOV-3 ovarium člověk adenokarcinom, Pt - primárně rezistentní T47D prs člověk karcinom WB-F344 játra krysa normální Bunky mezenchymálního původu code Lokalization Organism Pathology G5:113 myš fibrosarkom HL-60 krev člověk leukémie IMM nervové imortalizované Jurkat krev člověk leukémie (lymfoidní) K562 krev člověk leukémie (erytroidní) MOLT-4 krev člověk leukémie (lymfoidní) ML-1 krev člověk leukémie (myeloidní) NB4 krev člověk leukémie (myeloidní) U937 krev člověk leukémie (monocytární) V79 fibroblasty křeček normální (fibroblasty) WEHI krev myš leukémie (lymfoidní) Metody používané v laboratoři cytokinetiky BFU AV CR, Brno Legend: FACS - flow cytometry FM - fluorescent microscopy SM - light microscopy WB - western blotting FM - fluorimetry (FluoStar) CM - kolorimetry (FluoStar nebo Elisa reader) LM - luminometry (VUVEL, Lojek) PAGE - Polyacrylamid electrophoresis RT-PCR - reverse transcription polymerase chain reaction RG - radiography ELFO - agarose electrophoresis Metody průkazu apoptotické formy buněčné smrti method, molecules Princip, function, parameter Legend DAPI staining Studium morfologických změn buněčného jádra apoptotických buněk FM Annexin V - FITC + propidium Jodid (PI) Externalizovaný fosfatidylserin apop. buněk + zachovaná semipermeabilita (detekce rané apoptózy) FACS, FM TUNEL + PI Průkaz specifické fragmentace DNA (DNA zlomů - nicku - ss DNA breaks) FACS, FM SubG0/G1 peak v distribuci buněčného cyklu Barvení buněčné DNA propidium jodidem s extrakcí nízkomolekulární DNA citrátovým pufrem FACS PI - Hoechst double - stain Rozdělení buněk na mrtvé/živé, podle morfologie jádra identifikace apoptotických buněk FM DNA žebřík Průkaz fragmentace DNA na 180 bp fragmenty (tzv. ladder) ELFO Kaspáza 1, 3, 7, 8, 9 Detekce exprese specifických proteáz WB Caspase assay (c-3, -6, -8, -9 subs.) Důkaz aktivity specifických proteáz štěpením specifické sekvence na fluorescenční substrát FM cytokeratin 18 - protilátka M30 Neoepitop vytvořený štěpením cytokeratinu kaspázou FACS, Lamin B Degradace Laminu B kaspázami WB PARP Detekce štěpení proteinu PARP WB JC-1, TMRE, DÍOC6, MitoTracker Red, Rh 123 Detekce změn mitochondriálního potenciálu A^m FACS Hoechst + propidium Jodid (PI) Detekce apoptických, nekrotických a sekundárně nekrotických buněk (detekce i pozdní apoptózy) FM F-aktin Detekce intenzity polymerizace a depolymerizace aktinu (pomocí konjugátu faloidin-FITC) FCM, FM Intracelulární pH Průkaz poklesu intracelulárního pH vůči fyziol. hodnotě nutného k aktivaci enzymu DNA-ázy Izolace cytochromu c z cytos. frakce Vylití Cyt. C z mitochondríí do cytosolu a formování komplexu s Apaf-1 a procasp-9 vytváří apoptosom WB OxPhos Complex IV subunit II Studium funkce mitochondrií WB_______ i Proteiny a molekuly spojené s procesem apoptózy method, molecules Princip, function, parameter Legend Bad, Bag-1, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-X, Bcl-XL, Bid, Mcl-1 Bcl-2 rodina - regulátory průběhu apoptózy WB c-FLIP Inhibitor kaspázy 8 WB c-IAP1,XIAP Rodina inhibitorů kaspáz WB Hydroethidin, 2',7' dichlorofluoresceindiacetát Stanovení respiračního vzplanutí a produkce ROS provázející apoptozu FACS Dihydrorhodamin 123 Stanovení respiračního vzplanutí a produkce ROS provázející apoptozu FACS Lucigenin_________________________ Stanovení respiračního vzplanutí a produkce ROS provázející apoptozu LM_______ Metody stanovení úrovně proliferace, cytotoxicity, viability 1 method, molecules Princip, function, parameter Legend 1-------------------- Počítání buněk Počítač částic založený na principu konduktivity ------ Coulter counter Dye exclusion assay - eosin, trypanová modř Barvení mrtvých buněk s permeabilizovanou membránou SM Dye exclusion assay - propidium Jodid Barvení mrtvých buněk s permeabilizovanou membránou FACS MTT, WST-1 Stanovení relativního množství buněk metabolizujících tetrazolove soli MTT, WST-1 na formazanove produkty CM CyQuant Kit (Molecular Probes) pro značení DNA speciální fluorescenční barvou - proliferační assay FM PCNA Marker proliferace - podjednotka DNA-polymerázy ô a 8 WB, SM Inkorporace BrdU Analog deoxyuridinu se inkorporuje během replikace DNA v proliferujích buňkách FACS, FM Inkorporace 3H-thymidinu (izotopová metoda) Triciem značený thymidin se inkorporuje do buněk během replikace DNA - scintilační hodnocení RG Clonogenic assay Otreatovane buňky rostou v médiu nebo na agaru, sleduje se schopnost vytvářet kolonie buněk Metody analýzy buněčného cyklu Methods, molecules Princip, function, parameter Legend Barvení pomocí PI (např. Vindelův roztok) Distribuce buněčné populace podle množství celkové buněčné DNA do jednotlivých fáz bun. Cyklu FACS Mouse anti-BrdU-FITC + PI Sledování syntézy DNA na základě inkorporace BrdU do DNA proliferujících buněk FACS Pulse-chase BrdU labeling Sledování průchodu buněk cyklem FACS Proteiny spojené s regulací buněčného cyklu Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda cyklinA Řízení S - G2 fáze b. cyklu - asociuje s cdk 2 WB cyklin D1 Řízení přechodu z fáze G1 do S - asociuje s cdk 4 WB cdk 2 activity assay Řízení S - G2 fáze b. cyklu - asociuje s cyklinem A RG cdk4 Řízení přechodu z fáze G1 do S - asociuje s cyklinem D WB p15, 16 Rodina p16 - inhibující kinázy cdk 4 a 6 WB p21/waf1/cip1/sdi1/pic1 Inhibitor cdk a DNA replikace, transaktivovaný pomocí p53 WB p27/kip1 Inhibitor komplexů cyklin D-cdk 4, cyklin A-cdk 2 WB Topoizomeráza Na Replikační faktor - marker pozdní S/G2/M fáze b. cyklu WB pRb Onkosupresor zastavující ve fosforylované formě b. cyklus v souvislosti s p21 WB p53 Tumor supresorový gen - "Guardian of the genome" - downstream reguluje p21/waf WB i Metody detekce diferencujících se buněk method, molecules Princip, function, parameter Legend CD11b, CD14 Znaky monocytární diferenciace lidských leukemických buněk FACS Nespecifické esterázy Stanovení aktivity oc-naftyl acetát esterázy (difer. leukemických buněk) CM Fagocytická aktivita Znak monocytární diferenciace leukem. buněk - pohlcení částic konjug. s FITC FACS N BT redukční test Se zvyšující se úrovní diferenciace roste počet reduk. formazánových zrn CM Aktivita alkalické fosfatázy Znak diferenciace kolonových buněk - disodná sůl 4-nitrofenyl fosfátu CM Nespecifické esterázy Stanovení aktivity nespecifických esteráz pomocí štěpení fluoresenčné sondy CFDA (karboxyfluorescein diacetát) FACS Intracelulární pH Stanovení intracelulárního pH jako markru diferenciace buněk pomocí flourescenční sondy SNARF-1 FACS Polymerizace aktinu FITC značený faloidin FM_______ Proteiny spojené s diferenciací buněk method, molecules Princip, function, parameter Legend RARoc Receptor all-trabs retinoic acid, indukující diferenciaci leukemických buněk WB RXRct Receptor aktivovaný 9-cis-retinovou kyselinou WB VDR Receptor vitaminu D, množství VDR moduluje růst a diferenciaci nádorových buněk WB l Mezibuněčná komunikace, anoikis, motilita buněk method, molecules Princip, function, parameter Legend FAK Nereceptorova tyrosin kináza zapojená v přenosu signálů z ECM | WB Cadheriny Složka desmosomu, nachází se v komplexu s cateniny | WB, FM y-catenin Složka desmosomu, nachází se v komplexu s cadheriny | WB connexin 43 Složka gap junctions (GJIC) | WB GJIC inhibition assay Testování funkčnosti GJIC pomocí luciferové žluti 1 FM Wound healing assay________________ Testování motility buněk | FM_______ Metabolismus kyseliny arachidonové method, molecules Princip, function, parameter Legend cytopl. fosfolipáza A2 Odštěpuje AA z membrán WB 5-lipooxygenáza Metabolizuje AA na leukotrieny WB Cyklooxygenáza 2 Metabolizuje AA na prostaglandiny, prostacykliny a tromboxany WB Uvolňování AA Uvolnění AA z buněk do media HPLC (VUVEL) i Signální dráhy receptoru smrti Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda Fas-L Ligand Fas-R - signál smrti WB Fas-R(CD95) Receptor smrti - aktivovaný navázáním Fas-L WB,FACS FADD Adaptérová molekula - součást DISC komplexu WB Toso Inhibitor Fas indukované apoptózy nacházející se na povrchu T lymfocytu WB TRAIL Ligand TRAIL-R - signál smrti WB TRAIL-R1,2(DRs) Receptory smrti - aktivovány navázáním TRAIL-L WB.FACS TRAIL-R3,4 (DcRs) Decoy receptory - vážou TRAIL, ale neaktivují proces apoptózy WB,FACS Kinázy a proteiny s nimi asociované Název metody, stanovované molekuly Ras, N-Ras Princip, funkce, parametr Mebránový G-protein Legenda WB ERK1/2 Imunochemické stanovení neaktivní a aktivní (fosforylované formy) WB p38 Imunochemické stanovení totální (na fosforylačním stavu nezávislé) hladiny p38 WB JNK/SAPK activity assay stanovení aktivity analýzou fosforylace substrátu (radioizotopová metoda) RG Akt/PKB Serin/Threoninová protein kináza, může stimulovat Ras WB pTyr Protilátka detekující fosforylovaný Tyrosin WB pSer Protilátka detekující fosforylovaný Serin WB 1 Signální dráha TGFß Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda TGFßl Růstový faktor WB TGFß R I, II Receptor pro TGF ß WB Smäd 2, 4 Aktivace TGF R vede k translokaci těchto transkripčních faktorů do jádra WB I Proteiny asociované s AhR I Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda AhR WB, RT-PCR Ligand-dependentní transkripční faktor, I EMSA, I FM Reporter gene assay for AhR Metoda stanovení aktivity Ah R I LM Stabilní transfekce mutantních variant Ah R a ARNT pomocí plazmidových vektorů ARNT Jaderný partner receptoru AhR umožňující jeho vazbu na XRE element I WB, RT-| PCR CYP1A1__________________________ Oxidáza se smíšenou funkcí patřící do rodiny cytochromů P450 I WB, RT-| PCR Proteiny spojené s hormonální regulací Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda ER a, ß Receptory estrogenů | WB Reporter gene assay for ER Metoda stanovení aktivity estrogenních receptoru I LM Cathepsin D Endopeptidáza indukovaná estrogeny | WB LRP/MVP Ribonukleoproteinove částice ovlivněné hladinou estrogenů | WB PPARy Jaderný receptor pro hormony ovlivňovaný MAPK | WB Transkripční faktory a asociované proteiny Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda NF-kB Aktivátor řady genů spojených s hematopoezou, apoptózou atd. WB, EMSA IkB Inhibitor NF-kB, který jej zadržuje v cytoplazmě WB c-Myc Po navázání heterodimerizačního partnera Max působí jako TF WB p53 Onkosupresor podílící se na řízení oprav DNA lézí WB AP -1 (Jun + Fos)__________________ Homo- či heterodimerní transkripční faktor_________________________________________________I WB, EMSA Zvláštní pozornost věnována Vnt signalling FGF signalling TGF beta signalling Apoptotickým proteinm Regulátorům d if. a b. cyklu PUFAs Jejich vzájemným vazbám Užití Výroba Výzkum Aplikovaný (cílený) Základní Snaha o naplnění cyklu a důsledky pro finanční zajištění fliofyzikólni úslov flVCIl, RRNO Podstata návrhu projektu TREATMENT membrane-►cytoplasm -►nucleus (SIGNALING PATHWAYS) Environmental imbalance of pollutants \ prooxidative/ (PAHs, PCBs, TCDD) antioxidative processes PUFAs ^ imbalance Cytokines / at the level (TGFß 1, TNF^cí) ofPUFA metabolism EFFECTS apoptosis cell cycle and proliferation o*^ ve** ...\c - P' .^o*' if»*1 f\o*' c**** ,c^c »o***1 ,VN^ VfÜ1 :* ) Liverpool A Virm4ftghäm;Ams(crd ßp flmrg * Hrt-mcií^N Bei S LilíťS- E i 5arls LU7C r LATI Baltic 5ea KS ŮJwm/ \ V LITHUAnijl Vilnius] Gcfaň&Jk^ VHrc Names „GERMANY^ }rjii>kíijri ^ ~\ StrasbouT^^A ^-^Myr ^1 5í\>í"^ * ^ Vienna- zŠ*fferi ~ ^E jM - Warsaw ŕ »Bl Linz na n ^T^* "POLAND 1 ^dz Wroclaw , \sfr-,Jtí- iSfř-^s- .V, 'SPrFJ : Lvu»! . . ^ ^i i ubi M"fl^ssííhI rrv/i Hltao, .Toulouse mó^aľo ■ * . J^v ™ Andorra , ^ ^ft- LíyuijjM itoerii^ j\ I ^Š^P**^ "vXíTAlA- Corsica J .ßöiiie*"' Our goal is to move the borderline in this direction Projects (Centres) included into CETEC Mendel Research Center (MRC) Center for Human and Animal Health (CHAH) enter of Biomedical Research (CBR) Center of Advanced Materials and Technologies (CAT) Center of Electron Microscopy (CEM) Integrated Center for Science computational and Information Technologies Congress Center ^ XtčSflC Amongst the CETE Projects, the most important is so called MRC Project, since "it integrates the most sophisticated technologies of biological research Core facilities I Optical microscopy Flow-cytometry and sorting Genomics and proteomics NMR spectroscopy Electron microscopy Animal and Plant Cultivation Separation and Detection Computing technologies Testing of drugs Cell cultures, stem cells Core facilities II Material Sciences Nano- and Microtechnologies Communication technologies Biomedicine technologies V čem spočívají největší možnosti V míře osobního nasazení Opravdovém zájmu Využití příležitostí P1220013.JPG ciborcitory ytokinetics Institute of Biophysics. Arno Academy of Sciences Czech Republic Nabídka práce na odborných tématech na Odd. FIŽ PřF MU v Brně. fffl u M Ca 2+ Ca 2+ M^MiMflMmfí^^ I Nuclear responses _ oborcil _ _ vlokineliky ik^klnf úslov HVČR, ARNO Interaction between signalling pathways Phorbol esters CSF-1 IL-3 GM - CSF PKC PKC GM - CSF R EFFECTOR e.g. G protein, kinase RESPONSE adenylyl cyclase ^ CAMP PKA Q? O * DNA syn cell cycle phases Modulace cytokinetiky látkami tukové povahy -závěry- Lipidy a zejména jejich složky vysoce nenasycené kyseliny (PUFA), včetně jejich metabolitů eikosanoidů, patří mezi významné epigeneticky působící faktory schopné ovlivnit jak dělení a zánik normálních, ale i transformovaných buněčných populací, tak proces maligní transformace. T^ Riofyzikólní úslov I1VCI1, ftflMO Hlavní mechanismy působení PUFAs 1) přímé ovlivnění aktivity transkripčních faktorů regulujících expresi genů významných z hlediska cyto kin etiky 2) produkce eikosanoidů působících na přenos signálů růstových faktorů, cytokinů a imunitní systém I1S SQL EJufiES vznikajících peroxidací lipidů. fliofyzikólni úslov flVCIl, RRNO metabolitů v buněčných signalizacích (zejména v mech. regulujících cytokinetiku) již dosáhl obecně značného pokroku, řada otázek zůstává doposud nezodpovězena. Pokud jde o poznání úlohy fosfolipidového metabolismu v mechanismech účinků xenobiotik je výkum teprve v začátcích. PŘESTO LZE VYSLOVIT PŘEDPOKLAD, že jak fosfolipidové komponenty, tak jejich prekursory, by mohly hrát důležitou úlohu v mechanismech toxického působení xenobiotik, mj. i modulací drah řídících proliferaci, diferenciaci a smrt buněk, jejichž součástí jsou cytokiny a další fyziologické regulátory růstu. T^ Riofyzikólní úslov I1VCI1, ftflMO SlEtT!\\Pnmfz\[iMÉjÁ škála stresorů obercilor ytokinetiky Biofyzikálni ústov AVČR, ARNO li IV 4 3 'U ytokinetiky Biofyzikálni ústav AVČA, AANO BIOLOGICAL MEDIATORS THE ARACHIDONIC ACID CASCADE ■ Membrane:; 7+ r (J Re-esterification a*. .'."'"Cell -^. Membrane .(Phosphoiipase) COOH © Cyclooxygenase o A^cs^v^n^ COOH OH OH ♦ Lipoxins (A & B) Hydroxy Fatty acids (HETEs, HPETEs) Leukotriene B4 Prostaglandins Thromboxane prostacyclin TGkj-Cys-Giy I iTVvVv^cooh V—\OH c5Hn Leukotriene C4 —► LTD4 —> LTE4 Fosfolipidový metabolismus a působení škodlivých faktorů životního prostředí iciborcitoř ytokinetiky ftiofyzikální ústav AVČA, ßftNO Mitogens Growtlf Factors Hormones Serum Nutrient/GF Deprivation ?Heat ■ Environmental Stress UV light Ionizing Radiation Chemotherapy Xenobiotics 02, TM, Heat Cytokines Fas-Iigand TNF-alpha According to: Rizzieri: Drug Resistance Updates; 1: 359 - 376, 1998 laboratoř ytokinetiky Biofyzikálni úslov AVČft, ARNO effect lipoxygenase inhibitors differentiation agents + (MK886, esculetin) + (TPA, RA, DMSO) cell membrane cytosol cell cycle turnover unknown well documented some interactions ofTGF-ß1 andAA metabolism with other regulatory molecules which should be studied (unknown effects) ■ ciborcfttor _ytokinetiky Aiofyzikalnf ústav AVČR, ARNO Epigeneticky působící faktory, které mohou modulovat rychlost dělení, diferenciaci anebo zánik buněk Faktory, které mohou ovlivnit cytokinetiku změnami 1) exprese anebo funkce molekul zapojených v přenosu signálů přímo regulujících proliferaci, diferenciaci a buněčnou smrt (apoptózou), včetně exprese protoonkogenů a nádorově-supresorových genů 2) signálů, které tyto funkce ovlivňují do určité míry nepřímo, jako jsou inhibice mezibunecných spojení, ovlivnění funkce enzymů reparujících DNA, metylace DNAapod. fliofyzikólni úslov flVCIl, RRNO