EkoloxikologickkWiotesty ,Toxicita & genotoxicita na prokaryotíckých „Možná, jte se vám panel doktore zdá, že tady nikdo není. Ale j á ji tuším , tu bestii bakteriálni!" Kresba® Pavel Kanto rek RNDr. Pavel Cupr, Ph.D. Procaryotes ♦ DNA is not in a membrane; is a circular chromosome. Lack other membrane-enclosed organelles. ♦ DNA is not associated with histone proteins. ♦ Cell walls contain peptidoglycan. Special st Shsipos of Procaryotes 1 _L<).2 to 2.0 jim in diameter__ • 2 to 8 fiiii in length Testy toxicity TEST TOXICITY: experimentální design KONTAMINANT vzorek z ŽP - Testy jsou prováděny v adekvátní ředící řadě! - Biologický materiál jen ve stejné kvalitě, - Standardní podmínky testu. LOEC, NOEC, EC™, IC Provedení testu na bakteriích Testovací kultura Kvantifikace (ucho/ivání, kultivace) ^vizuální, instrumentální) Reakční systém \ 77T '. 1 \T _______\ Vybraný (optimální podmínky) Vmrametr 1 ^*r i |odPovčď| i (odběr, úprava, ředění) 1----------------, Hodnocení 5 i-- / Provedení testu na bakteriích Testovaný vzorek Negytivní kontrola Positivní kontrola Blank Negativní kontrole Blank: není testov \ —[ h: ľ vzor ací kul Y / Inkubace --------*| Odpověď x 7\ ' 'm Inkubace --------<\ Odpověď —<\ * 7 , , J^ řnkubace --------\ Odpověď [ ek tui nahrazen rozpouštědlem -a ECHA BIOCIDE Monitor Impregnace & kultura Bacillus species & indikátorové barvivo (terzoliového typu) (ŕ živné médium Kontakt se vzorkem Voda (extrakt) Sediment, půda, odpad 10 s kontakt se vzorkem 18-24 hodin inkubace (dle typu použité bakterie) 35-37 °C 1 / \ \ L Bílá Růžová (tečkovaná) Červená I Toxický Mírni toxický Netoxický » Miniaturizace testů ĚMZCodE rri'rn "na au ^^H jg^ D6 3 OD 2 1 I 4C )0 450 500 550 600 650 ------1 rim 1 700 ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^_ Vyhodnocení testů Testov/ný vzorek |— Negytivní kontrola |— i Politivní kontrola Blank |-Aktivita ftlh) - Aktivit \ Y / -*| Odp/věď x -| Odpověď N | 1 Ě -| Odpověď f ntrola A Inkubačné i \ / \ H Inku bace H X 1 1 #nkubace i (to/) v.s. negativní ko % inhibice (i ako sledo\ 'any ef ekt) = ľ(Atl-At0)/O \ktl-Akt0)l * 100 ' 16 MICROTOX - Akutní test toxicity (BioFix® Lumi) Sal in n í baktérie Vibrio fischeri vykazující bioluminiscenci > redukce intenzity biolouminiscence vlivem působení škodliviny > vzorky: chemikálie, jejich směsi, odpadní vody, extrakty sedimentů a půd > dobře reprodukovatelný L (Příprava základního ean« roztoku, úprava pH raifflii * eeeeeieiee * Příprava suspenze bakterií Příprava testovacích roztoků Stanovení počáteční I a Přídavek škodliviny . [g začátek testu I Inkubace 10-30 m 3Ä Stanovení konečné lu Vzorky by měly být před měřením upravovány: pH, salinita (2 %). Je-li hodnota pH v rozmezí od 6 - 8,5, \é pH upravovat (BioOrbit 1996). I________________1 Při úpravě pH je nutné citlivě připravit roztok HCl či NaOH o takové koncentraci, která optimálně upraví pH roztoku co nejmenším objemem - tím lze zabránit nežádoucímu naředění vzorku. Celý test probíhá při teplotě 15 "C. Test má také variantu "solid phase".____________________ / //// ľmiuT vziHvli mu/lilium />• .,_"" .,_"" ni. pn/Miliu- i snil yin lil ______________________i^inui-l\iiu-l\Áu-nc,l5 < •'_____________ 5, 10, 15, 20, 30 minut. Sleduje se jen jeden endpoint, nebo kinetická odpověď bakterie v několika zvolených intervalech._____________________ 15 "C. Pozitivní kontrola ZnSC>4. Aseptická práce | Není Mutatox Organismus Využívání bakterie Vibrio fischeri - ..dark mutant" - za normálních ■■-:>:.■:-. ■:■. .:.:>:.■::. , <■ ■-> \ Princip Jedná se o mutanta. u kterého je emise světla způsobena až reverzní mutací za přítomnosti mutagenních látek. (Ulitzur et al. 1980). Lyofilizované bakterie jsou rehydratovány a exponovány toxickou látkou. Po 16-24 hodinách se měří emise světla luminometrem. Test je prováděn s i bez enzymové aktivace S9. Použití +S9 je popsáno v práci Johnson 1992, aplikace bez -S9 v článku Kwan et al. 1990. \ Reakční směs (V) 500 fil. IPředkultivace .•<>:•:.■::.! i.-""'' i-■..-.■. ..,:■.■. \ Trváni testu 16-24h. \ Dodání S9 směsi má tendenci zvýšit detekční limit a snížit jednotnost výsledků, což může být vysvětleno nestandardními podmínkami pro metabolizaci (bakterie vyžaduje jen 15 "C, zatímco S9 směs byla vyvinuta pro Ames test při 37° C). S výsledky Mutatoxu také může interferovat cytotoxicita (stejný případ i u Ames testu). Zde se však může provést jako kontrola populačně růstový test založený na buněčné hustotě. (Willemsen et al. 1995). Byla potvrzena vysoká 93 % shoda s Ames testem (Legault et al. 1994). Mutatox byl schopen z 82% správně odlišit (ne)karcinogenní látky ve srovnání s Ames testem, který měl tuto schopnost nižší (73%). 1 Teplota 23 ± 1 "C. Třepáni Ne. 2-AA, 2-AF, BaP.. Aseptická práce Ano. 1 Doporučení Test je doporučen provádět v kombinaci sMicrotox testem, který mu musí předcházet (Hauser et al. 1997). ^xtrakckA^P = „nozbití" buněčná stěny a i včetně ATP «trakční činidla: TCA^ chlorid, DMSO... gent - benzethoi mozna mhibice luciferazy extrakcnim činidlem —> ředění (TCA) nebo neutralizace (benzethonium ch D ATP-TOXsystém Organismus Libovolná kultura. ATP-TOX system využívá měření aktivity buněčné ATP jako indikátoru růstové inhibice. Základní test pro měření ATP je založen na měření světelné luminiscence, která následuje po reakci luciferinu s ATP za přítomnosti luciferázy a horečnatých iontů. Tento systém může být využit pro měření jakékoliv bakterie nebo řasy, která rychle roste v laboratorních podmínkách (Důtka 1988). Zkumavky se inkubuji na rotační třepačce po dobu 5 hodin a po té se měří celkové množství vyprodukované ATP pomocí luciferin-luciferázové aktivity (dodává se luciferin-luciferázový roztok do testované směsi) na luminometru. Vzorek může inhibovat schopnost pndané luciferázy ment produkci ATP, proto je třeba ještě ověřit, zda tento jev nenastal. Reakční směs (V) 1 ml. (200 ul roztoku enzymu + 800 ul vzorku) Předkultivace Závisí na typu kultivovaných buněk (18-24) Trvaní testu Po proběhlé expozici se provede rozrušení stěn buněk (činidlem - TCA, trichloroctová kyselina, sono - ultrazvuk). Tím dojde k uvolnění ATP do r.ci.'kii .v ku-i\-li>> s>' ..,/>■/>//'./ mih ul i.-../-/,//./.. iv.ik. ni \iiu\i Teplota Závislá na vybrané kultuře. Třepáni 1 '.>/>.>/'//. >■//>■ Pozitivní kontrola Chemické látky musí být vybírány s ohledem na možnou inaktivaci .iizmiiii iwr pnu. i/'i Aseptická práce Ano 1 Test na aktivitu t enydrogenáz Organismus /U/////W.7V//V .,ii\i:Ullh Princip Jedná se o tes ve kterém je aplikována sbírková kultura bakterie Bacillus cereus Imo do vzorku pevného skupenství a její poškozeni se sleduje pomoc spektrofotometrického měřeni změn v množství specifickoho substrátu resazurinu (601nm), jehož redukce je úměrná změnám v aktivitě dehydrogenáz sledované buněk. Alternativou odečtu výsledků je spektrofotometrická detekce vznikajícího resorufinu (571nm). (Rönnpagel et al. 1995). Reakční směs (V) 6 ml. Předkultivace 18 hodin při kontinuálním třepáni (220 rpm) při teplotě 21 "C, 1 (OD60i=0,4). Trvaní testu 4 hodiny. Teplota 21 °C. Třepáni Kontinuální třepáni 70 rpm. \ Aseptická práce ľmi-c pri pr,ui \c r