Testy toxicity sedimentů
K.Hilscherová
Sedimenty
- velmi různorodé složení - polotuhá matrice - pevná
fáze(částice) a pórová voda
* v podstatě akvatický ekvivalent půdy
- heterogenní prostředí - směs jílu, písku, minerálů,
huminových látek, odumřelých organismů a antropogenních
polutantů
- akumulace a inaktivace polutantů
(např.AVS ­ kovy, Corg ­ PAHs)
* primární úložiště biotického i abiotického materiálu (včetně
polutantů) v akvatickém prostředí
* akumulace polutantů v sedimentech může způsobit:
1. Změny ve struktuře bentických společenstev
2. Zvýšené zatížení organismů polutanty
3. Toxicitu
Klasifikace sedimentů
1. Obsah organického uhlíku ­ ovlivňuje sorpci
neutrálních organických látek zvýšené Kow =
zvýšená sorpce
2. Distribuce zrnitostních frakcí ­ větší částice mají
tendenci sorbovat méně poltantů
3. Obsah a typ jílu
4. Kationtová výměnná kapacita (KVK)
­ ovlivňuje sorpci kationtů
1. pH ­ ovlivňuje speciaci kovů, sorpci
Další fyzikálně chemické parametry
­ DO, salinita, amoniak
Transport a resuspendace sedimentů
Proudy, povodně, vítr, vlny
- Způsobují pohyby sedimentů v závislosti na jejich velikosti
Porová voda
* Voda mezi částicemi sedimentů
* Nepolární pollutanty sedimenty porová voda
vodní sloupec
* Primární zdroj expozice polutantů pro organismy žijící v
sedimentu
Sedimenty mohou vázat polutanty, pak být překryty další
vrstvou sedimentů redukce biodostupnosti
Odběry vzorků sedimentů
- tyčové vzorkovače (vertikální profil, historie sedimentace)
- pasivní vzorkovače ­ sedimentové pasti (plaveniny)
- drapákové vzorkovače (směsné vzorky)
- SPMDs ­ odběr určitých typů polutantů (zejm. pórová voda)
Narušení fyzikálně chemických parametrů sedimentů
Manipulace se vzorky
* Uskladnění:
změny toxicity vzorků v závislosti na teplotě (chlazení (4C) vs. mražení
(<-20C)) , době uskladnění a stupni kontaminace sedimentů
* Úpravy vzorků:
1.) úpravy pH (6-9) ­ vliv na toxicitu a biodostupnost kovů (Zn, Ni, Pb,
Cu, Cd), amoniaku a sirovodíku
2.) lyofilizace vs. zmražení
3.) amoniak ­ odstranění amoniaku ze vzorku probubláváním nebo
přidáním zeolitu
4.) homogenizace
5.) kovy ­ odstranění kovů přidáním EDTA nebo sulfidů
6.) výluhy (vodné/organické) vs. SPTs ­ změny toxicity eluátů v
závislosti na volbě rozpouštědla (voda, methanol, DCM) vs. toxicita
biodostupné frakce kontaminantů
7.) pórová voda vs. SPTs
Testy se sedimenty
* Organismy v sedimentu vystaveni látkám zachyceným v pevné i
kapalné složce matrice
* Pro bentické organismy - biodostupnost chemických stresorů v
sedimentech.
* Sediment = potenciální dlouhodobý zásobník/zdroj kontaminantů
uvolněných do vody
* Může být nezbytné remediovat kontaminované lokality bagrováním
nebo odstraněním sedimentů
* odstranění sedimentu, jeho transport a uložení mohou být velmi
nákladné; studie toxicity umožní identifikovat nebezpečně
kontaminované lokality ­ kde je třeba odstranění, kde možno
ponechat bez významného rizika.
* Zejména EPA a ASTM metodiky
Jak hodnotit toxicitu sedimentů?
Toxicita porové vody/výluhů (několik ISO / OECD
norem)
: 100 g d.w./L vody, 24h pomalé třepání, filtrace, test
V. fisheri (30 min), řasy, bezobratlí - D. magna (2 dny)
? Vodný výluh vs. Sediment
Doporučeny nejméně 2 různé druhy (např. Hyalella, Chironomus, Daphnia, ...) a dva různé
sledované parametry (např. růst, přežití, reprodukce...)
Kontaktní toxicita (jen málo norem ...)
: sedimenty+organismy & hodnocení účinků ­ červi, hmyz, šneci ... dny - týdny
Skríningové testy toxicity/genotoxicity
Bakteriální modely
Testy s výluhy sedimentů:
* Vibrio fisheri (Microtox) ­ 0,5 h
* Escherichia coli (Toxichromotest) ­ 2 h
Kontaktní verze testu
* Flash test s Vibrio Fisheri ­ kinetický test - stanovení inhibičního
účinku vzorků na světelnou emisi Vibrio fischeri
* srovnatelné se statickou zkouškou s luminiscenčními bakteriemi
podle ČSN EN ISO 11348
* Flash verze - eliminace vlivu zákalu a zbarvení vzorku, umožňuje
provedení testu se suspenzí vzorku bez přípravy vodného výluhu.
Je mezistupněm ke kontaktním zkouškám ekotoxicity
Testy genotoxicity s výluhy:
* SOS chromotest
* umuC test
* GFP test atd.
Nástroje pro hodnocení
* Základní požadavky
­ Měření zakalených (barevných) materiálů
­ Schopnost rozlišení TOXICKÝ - NETOXICKÝ
­ Rychlost
* Bakteriální bioluminiscenční testy toxicity
­ Klasické ­ Microtox, BioToxTM, LUMISTox aj.
­ Alternativní ­ modifikace klasických testů (např.
BioToxTM Flash test*)
* Lappalainen, J. et al. (1999): Chemosphere, 38(5), pp. 1069-1083.
Microtox
* Vibrio fischerii
- Mořská bakterie schopná bioluminiscenece
Design:
- Akutní
- mikrodestička
- Endpoint: inhibice bioluminiscence
- Luminometr ­ t = 0, 15, 30 minut
- Testování vodného výluhu
Flash test
* Vibrio fischerii
- testováni zakalených a barevných
vzorků, bez potřeby referenčního
materiálu
design:
- akutní
- inhibice bioluminscence
- mikrodestička
- luminometr s dispensorem
- nutné vzorek protřepat (během měření)
- krátká doba měření ­ Hodnota píku
Smax (0-2s) v porovnání s píkem
S30s (po 30s měření)
Akutní testy toxicity I.
* Porová voda
* Eluát ze sedimentu
* 48-96 h expozice
* Příprava eluátu: 24h třepání, 100 g sedimentu/1L vody
* Druhy: Daphnia magna, Daphnia pulex, Ceriodaphnia
dubia, střevle potoční (Pimephales Promelas), pstruh
duhový (Oncorhynchus mykiss)
* Sledované parametry: přežívání, imobilizace
Akutní testy toxicity II.
* Kontaktní testy - Celý sediment
* 96h ­ 10 dní expozice
* Druhy: různonožec (Hyalella azteca), jepice
(Hexagenia limbata), pakomár
(C.tentants/riparius)
* 10-denní test s Hyalella azteca a Chironomus
tentans
* Sledované parametry: přežívání
Chronické testy toxicity I.
* Porová voda
* Eluát ze sedimentu
* 7-35 dní expozice
* Druhy: Ceriodaphnia dubia, střevle potoční (Pimephales
Promelas), pstruh duhový (Oncorhynchus mykiss)
* Sledované parametry: přežívání, imobilizace, růst,
reprodukce, doba první reprodukce, doba úhynu,
přežívání mladých
Chronické testy toxicity II.
* Kontaktní testy - Celý sediment
* Zpravidla 28 dní expozice
* Druhy: různonožec (Hyalella azteca), pakomár
(C.tentants/riparius)
* Sledované parametry: přežívání, imobilizace, růst,
reprodukce, doba první reprodukce, doba úhynu,
přežívání mladých
* 28- a 42-denní testy s H. azteca
* Sub-chronické a celoživotní testy s Chironomus tentans
* 10-denní krátkodobý chronický test s larvami
obojživelníků
Ekotoxikologické biotesty se sedimenty
­ přehled EPA
g
a
t
u
s
t
e
c
a
u
s
w
o
r
m
"
s
www.epa.gov
Ekotoxikologické biotesty se sedimenty
­ přehled EPA
www.epa.gov
Testy toxicity sedimentů ASTM
Testy toxicity sedimentů ASTM
Tubifex tubifex - Nitěnka obecná
* Součást makrozoobentosu
* Relevantní organismus pro sediment
* Inhibice pohybu a letální koncentrace
kmen: KROUŽKOVCI
třída: opaskovci
podtřída: máloštětinatci
Spíše chroničtější expozice ­ viz. Chronické testy
­ pakomáři, mlži, korýši, kroužkovci - Hyallela, Lumbriculus
Testy toxicity sedimentů
Akutní test
Účel: Test je určen k hodnocení akutní toxicity látek na nitěnky. Nitěnky patří
mezi nejčastěji a nejdéle používané testovací organismy.
Princip: Test spočívá ve sledování chování a přežívání nitěnek
v odstupňovaných koncentracích látky ve srovnání s kontrolou
v ředící vodě. Expozice je 48 h. Možno i prologovaný 10-14 denní test
Hodnocené parametry: přežívání, aktivita, bioakumulace
Testy s larvami pakomárů rodu
Chironomus
* OECD 218 Sediment-Water Chironomid Toxicity Test
Using Spiked Sediment
* OECD 219 Sediment-Water Chironomid Toxicity Test
Using Spiked Water
* USEPA 2000 Celoživotní (Life-cycle) test pro hodnocení
účinků kontaminace sedimentů s pakomárem Chironomus
tentans
Chironomus riparius Meig.
(pakomár)
Charakteristika modelového druhu
* rod Chironomus - řád dvoukřídí (Diptera) = hmyz
s proměnou dokonalou
* vajíčko-larva(4 instary)-kukla-imago
* dominantní konzumenti 1. řádu v rámci
sladkovodních akvatických
ekosystémů
* značná ambundance
* kosmopolitní rozšíření
* larvy - všežravci
- živí se řasami, rozsivkami,
detritem
10-denní test s larvami pakomárů rodu
Chironomus
Nasazovány larvy ve stadiu 2-3
instaru (cca 10 d staré)
10 jedinců/kádinku
100 ml sedimentu/175 ml vody
Teplota 20  2°C
Pravidelné krmení, vzduchování
Fotoperioda 16 h světla / 8 h tmy
Sledováno pH, kyslík, vodivost
Po 10 dnech hodnoceno přežívání a
růst
Celoživotní (Life-cycle) test pro hodnocení
účiků kontaminace sedimentů s pakomárem
Chironomus tentans
Nasazovány larvy mladší jak 24 h
12 jedinců/kádinku
100 ml sedimentu/175 ml vody
Teplota 20  2°C
Pravidelné krmení, vzduchování
Fotoperioda 16 h světla / 8 h tmy
Sledováno pH, kyslík, vodivost
Doba expozice 50-60 d (ukončeno 7 dní po
posledním vylétnutí)
Hodnocené parametry: 20-denní přežívání a
váha (růst), vylétávání samiček a samečků
­ poměr pohlaví, doba vylétávání, počet
nakladených vajíček, přežívání dospělců
Podobné
uspořádání jako
v 10-denním
testu
Celoživotní test - dle OECD
#218/219
* provádí se v 600ml kádinkách
* sediment artificiální nebo přírodní
* voda - studniční, povrchová,
provozní, uměle připravená
* sediment : voda 1:4
* 20 2°C, 500 ­ 1000 lux, 16L : 8D
A. nylonová síťka
B. plastový kryt
C. kádinka bez zobáčku
D. otvory na výměnu vody
E. sediment
kontaminace: sedimentu
vody nad sedimentem
koncentrační řada: aspoň 5 koncentrací
f  2
kvalita vody - pH 6-9, rozpuštěný kyslík aspoň
60% ASV, změřit tvrdost a amoniak
vzdušnění ­ Pasteurovou pipetou (jemně)
Celoživotní test - dle OECD
#218/219
* 1-4 dny staré larvy vysazujeme do
sedimentu
* 20 jedinců/kádinka
* počet opakování: 3 - ECx; 4 - NOEC,
LOEC
* krmení­ tetrafinR, 0,25-0,5mg/larva/den
* délka trvání ­ 28d (C.riparius)
Celoživotní test - dle OECD
#218/219
Cílové parametry:
* procento líhnutí dospělců:
ER: procento líhnutí dospělců (emergence ratio)
na: počet jedinců vysazených do kádinky
ne: počet vylíhlých jedinců celkem (na konci pokusu)
Přijatelnost testu: ER kontroly >0,7
* střední čas vývoje: čas od vysazení do líhnutí
a
e
n
n
ER =
ˇ střední rychlost vývoje:
x: střední rychlost vývoje v kádince
i: index intervalu mezi pozorováními
m: počet všech intervalů mezi pozorováními
fi: počet vylíhnutých jedinců během daného intervalu
ne: počet vylíhlých jedinců celkem (na konci pokusu)
xi: rychlost vývoje larev vylíhlých v intervalu i
deni: den pozorování (od začátku)
li: délka intervalu mezi pozorováními (obvykle 1 den)
e
ii
m
i n
xf
x =
=
0
2/
1
ii
i
lden
x
-
=
Cochran-Armitage test, Fisher's exact test, Mantel-Haentzal
test s Bonferroni-Holm úpravou p-hodnot, ANOVA (+arsin
transformace)
Procento
vylíhnutých
jedinců
Chi-squareZávislost citlivosti
na pohlaví
ANOVANOEC, LOEC
Regresní analýzaECx
Projevy u bezobratlích:
Narušení reprodukce, rodivosti (fekundita)
Poruchy růstu, sexuálního dozrávání (maturace)
Narušení sexuálního dimorfismu, Intersex, Imposex
další procesy řízené hormony: pigmentace,
regenerace končetin, diapauza
Sagi et al. (2003) ­ Cherax quadricarinatus
Rudolphi (1999) ­ Samastacus spiniformis
Suzuki (1999)
­ Armadillidium vulgare
?AG
Barki et al. (2003)
Jungmann et al. (2004)
- Gammarus fossarum
Endokrinní disrupce (ED) = narušení hormonální rovnováhy
organismů s potenciálními negativními následky pro celkovou
homeostázu, reprodukční, vývojové a behaviorálních funkce
SUBLETÁLNÍ TOXICITASUBLETÁLNÍ TOXICITA
U VODNÍCH MĚKKÝŠŮU VODNÍCH MĚKKÝŠŮ
- vodní měkkýši využíváni jako testovací organismy pro
vyhodnocení účinků endokrinních disruptorů ve vodním
prostředí
Test sedimentů s písečníkem
novozélandským PotamopyrgusPotamopyrgus
antipodarumantipodarum
- vhodný a efektivní nástroj pro testování přírodních
sedimentů a čistých látek
- finančně atraktivní varianta oproti
chemickým analýzám sedimentů
mortalita; změny v morfologii pohl. orgánů;
počet embryí, poměr embryí bez ulity a s ulitou
parametry
20 jedinců po 4 (8) týdnechodběry
statická, 50 g sedimentuexpozice
800 ml vodymédium
objem 1 lnádoba
4 týdny (popř. 8 týdnů)trvání
+ nízké nároky na kultivace
- nedostatečná velikost pro biochemické
analýzy
ParametryParametry
,,,,PotamopyrgusPotamopyrgus sediment testu"sediment testu"
PřípravaPříprava
Typy sedimentů
o přírodní
o artificiální
listová hrabanka + křemitý písek
o spajkovaný artificiální sediment
vyhodnocení efektů čistých látek
(1) spajkování artificiálního sedimentu. (2) Po
odpaření solventu je přidáno medium (3)
ustavení rovnováhy mezi sedimentem a vodou,
po 4 dnech přidáni šneci .
1 2 3
2(3) dny
ve tmě
4 dny
Médium
- voda s přídavkem
NaHCO3, CaCO3
- 16°C,
700100S/cm
L:D 16:8
Komerční řasové
pelety
Expozice, vyhodnoceníExpozice, vyhodnocení
Parametry: mortalita a počet plně vyvinutých a nezralých
embryí
(Xeno)estrogenní účinek
- ethinylestradiol, bisfenol A, octylfenol, nonylfenol
Xenoandrogenní účinek
- tributylcín, trifenylcín
Biomonitoring dnových sedimentů (Nisa, Odra)
Kontaktní Testy Toxicity ovlivňující
faktory
* Faktory mimo kontaminace
* zrnitost sedimentů
* obsah a typ jílu
* Obsah a character organického uhlíku
* Struktura a vlastnosti huminových látek/organického materiálu
* pH
* obsah kyslíku
* Toxicita amoniaku /sulfidů
* Aktuální stav testovací populace
* Výživa
Změny toxicity sedimentů díky vzorkování a experimentálnímu
postupu
­ promíchání více kontaminovaných sedimentů s tenkou vrstvou na
rozhraní vody-sedimentů
­ Oxidace a precipitace redukovaných kovů díky provzdušňování
požadovanému v testu toxicity
Testy bioakumulace
* Kontaktní testy ­ celý sediment
* 28-56 dní expozice
* In-situ a/nebo Ex-situ testy pro zhodnocení příjmu
kontaminantů organismy
* Používány zejména na lokalitách kontaminovaných
bioakumulativními látkami (PAHs, PCBs, rtuť,
PCDDs/PCDFs, ...)
* Výsledky porovnávány s referenčními lokalitami a/nebo
povolenými limity
* Druhy: různonožec (Hyalella azteca), máloštětinatci
(Lumbriculus variegatus, nitěnka obecná)
Test subject: water
Test subject: sediment
Determination of
macrozoobenthos
saprobic index
functional feeding groups
life form index
evenness & diversity
Bioassays
toxicity, cytotoxicity
endocrine disrupting potential
genotoxicity, mutagenicity
Chemical analyses
organical analyses
limnochemical parameters
heavy metals
Ecosystem
native & concentrated surface water
whole sediment, sediment pore water, elutriate
and organic - extracts
Assessment
Identification
... in vitro and in vivo
bioassays
Integrated assessment
of aquatic ecosystems
In situ testy
* Klecování ­ měkkýši, ryby, další bezobratlí,
* Mortalita, zdravotní stav, příp. reprodukce a
specifické biomarkery v exponovaných
organismech
* Subletální biomarkery, histologie
THE SEDIMENT QUALITY
"QUADRAD"
Bioaccumulation
Tests/Fish Tissue
Analysis
Sediment
Toxicity
Benthic Community
Survey
Sediment
Chemistry