Základní podmínky kultivace in vitro Požadavky na vybavení laboratoře v Živná média Základní podmínky kultivace in vitro • aseptická kultura 1-----y nutnost sterilizace a desinfekce • vhodná výživa explantatu '-----r živná média • vhodné fyzikální podmínky - osvětlení - teplota - koncentrace plynů - vlhkost vzduchu Sterilizace a desinfekce A. Fyzikální • mechanická a elektrostatická filtrace vzduchu očkovacích boxu (laminarní proudění, 2. třída) filtrace roztoku termolabilních látek - filtry: skleněné (frity 65, S4) membránové (Seitz, Millipore, Sartorius) 0,22|Lim • UV záření (kultivační místnosti, boxy) • teplota suché nebo vlhké teplo 99 Očkovací boxy laminární proudění vzduchu do pracovního prostoru přes filtry: předfiltry a HEPA-filtry („High Efficiency Particulate Air") horizontální proudění: FATRAN (Slovensko) UKB 3.37 GELAIRE (Itálie) UKB 3.37 vertikální proudění: UNIFLOW (z Kolína/n. R.) - Řečkovice HOLTEN (Německo) UKB 3.37 AURA UKB suterén Vitro Centre International, Nizozemí horizontální proudění filtrovaného vzduchu = chrání materiál, ale ne pracovníka a prostředí Očkovací box 1. bezpečnostní třída (lepší digestoř) HEPA-filtr = „High Efficiency Particulate Air Class 1 HEPA-filter ---------- box nezajišťuje podmínky pro sterilní práci -chrání jen životní prostředí Očkovací box 2. bezpečnostní třída vertikální proudění vzduchu Class 2 HEPA-filter _>- m . - ■v re: í ......iniiiii Exhaust air I I i Ventilátor Laminar flow / HOLTEN, AURA - je možné pracovat i s ôMO = ochrana materiálu, pracovníka i prostředí Očkovací box 3. bezpečnostní třída Class 3 HEPA-filter Entry air M. Jt ——■ ■"■■ užití pro práci s vysoce infekčními, toxickými nebo radioaktivními materiály apod. Velikost filtrem zadržených Mechanismy zadržení částic: 1. efekt síta = velké částice 2. menší částice = inertní k proudění 3. nejmenší částice = BrownSv pohyb castic > 0#l|Lim = vlákna filtru Sterilizace teplem suché teplo - horkovzdušné sušárny s^\0 120-170°C -kahan nastpoje - sterilizační přístroj vlhké teplo voda, živná média, roztoky, 100 - 121°C filtrační papír, párátka normální tlak - zavařovací hrnec - Kochův sterilační přístroj vodou chlazený plášť zvýšený tlak - tlakový hrnec mm d nio^ - autokláv 100kPa< m C Sterilizace při zvýšeném tlaku vztah mezi teplotou a tlakem °c 115 120 134 143 kPa 70 100 200 300 (autoklav Chirana Brno, PS 20) Minimální doba pro sterilizace médií V QU tok lávu (katalog Sigma) objem média /ml/ doba /min/ teplota re/ 20-50 20 121 50 - 500 25 121 500 - 5 000 35 121 prázdné sklo filtr, papír 30 130 Změny v médiu při autoklávování (Pierik 1987) • snižování pH o 0,3 - 0,5 • štěpení sacharózy * glukóza a fruktóza • při dlouhé době » precipitace solí depolymerace agaru • rozklad termolabilních látek zeatin, GA, etylén kolchicin antibiotika rostlinné extrakty Sterilizace a desinfekce B. Chemická Oxidace - látky uvolňující: a) kyslík (H202, Persteril) b) element, halogeny (chlorové vápno, chlornany Chloramin B, SÁVO, Ajatin, Ďecidin) Koagulace bílkovin ionty kovu - Hg, Sn, Ag Sublimat HgCI2, Famosept SPOFA Ďetergencía - sri\žen\ povrch, napětí, smáčení hydrofóbních povrchu a poškození membrán (70% EtOH, Citowet, Tween, Triton-XlOO, Jar) Živná média - klasifikace složení konzistence způsoby kultivace Polypropylenová (PP) membrána (můstek) Magenta box tekuté médium podle katalogu Sigma RITA® - občasne zaplavovaný systém Fáze 4 - cyklus končí ukončením přetlaku medium stéká do spodní části nádoby www.vitropic.fr Fáze 1 - nejdelší trvání, pletiva bez imerze médiem Fáze 2 - začíná imerze, médiem, tlak vzduchu, který vstuouje přes filtr, vytlačuje tekuté médium k explantátäm Fáze 3 - výměna vzduchu uvnitř reaktoru Kultivační nádoby s ventilací vĺčka se speciální membránou propustnou pro plyny kultivační sáčky se speciální membránou propustnou pro plyny (Sigma) původně pro kultivaci hub na jedno použití sterilizace y zářením velikost póru 0.02 pm, autoklávovatelný Fyzikální podmínky kultivace < intenzita, vlnová délka, fotoperioda tma teplota <^ konstantní i ► klimatizace ^^ kolísavá (den x noc) koncentrace plynu: C02, etylén, 02 • • • těsnost uzavíraní __ kultivačních nádob vlhkost vzduchu Různé možnosti kultivace in vitro horizontální třepačky pro kultivace v tekutém médiu Hark Orchideen GmbHC Lipstaadt, Německo Katalog Ďuchefa kultivační regály pro kultury na agarem ztuženém médiu rotační kultivační systém pro kultivace v tekutém médiu ^ • Komerční kultivační místnost InVitro, Nizozemí z katologu Duchefa Ü % **& , i • * %^r -JMráLi Bioreaktory v roce 2005 největší automatický provzdušňovaný bioreaktor pro pěstování rostlinných buněk a orgánů na světě pracovní objem každého tanku 20 000 I (20 tun) celkový objem 160 000 I (160 tun) Foto: Sung Ho Son VitroSys Inc., Korea Povrchová desinfekce semen Uzavření semen do epruvety nebo gázy 1. roztok: 50 ml sterilní deštil, vody 1 minuta 50 ml 96% EtOH 10 ml 30% peroxidu vodíku Oplach sterilní deštil, vodou 2. roztok 20% SÁVO (v/v) 15-20 minut 3x oplach sterilní deštil, vodou vždy 3-5 minut Výsev na Petriho misky vlhká buničitá vata skleněné perly + voda médium ztužené agarem NicoŤiana tabacum L. - výsev semen selekce transgenních rostlin heterozygotní 1-3AI-7 na MS médiu bez MTX heterozygotní 1-3AI-7 na MS médiu s MTX kontrola SRI na MS médiu s MTX Složení živných médií (kultury jsou většinou heterotrofní) anorganické sloučeniny (minerální výživa) makroelementy mikroelementy organické sloučeniny (organická výživa) zdroj organického uhlíku - sacharidy zdroj organického dusíku - aminokyseliny, polyaminy vitamíny inositol (cyklický šestisytný alkohol) růstové regulátory (hlavně auxiny a cytokininy) ztužování médií (agar, Gelrite®) regulace pH (MES) Složení živných médií anorganické sloučeniny makroelementy: N, P, K, Ca, Mg, S mikroelementy: Fe, B, Cu, Mn, Ni, Co, I, dodávají se ve formě solí: sírany dusičnany fosforečnany chloridy Fe ve formě chelátu s EĎTA Složení živných médií organické sloučeniny • zdroj organického uhlíku = sacharidy mono- a disacharidy (glukosa, fruktosa a sacharosa) • zdroj organického dusíku = aminokyseliny: - směsi (kaseinhydrolyzát, kvasničný hydrolyzát) - čisté (glycin) - polyaminy (putrescin, spermin, spermidin...) • vitamíny: Bl, B6, kys. nikotinová, kys. listová, biotin • inositol • aktivní uhlí • přírodní látky - kokosové mléko - rostlinné šťávy - rostlinné drtě Složení živných médií růstové regulátory a ztužování • růstové regulátory - auxiny (NAA, IBA, 2,4-D, Picioram) - cytokininy (kinetin, BAP, TDZ) - gibereliny (6A3) - kyselina abscisová (ABA) • ztužování médií - agar = polysacharid izolovaný z mořských řas - gelrit = přírodní polysacharid produkovaný mikrobiální fermentací Makroelementy N, P, K, Ca, Mg, S • jsou důležité jak ve formě kationtů, tak aniontů • živná média jich obsahují řádově mM koncentrace Gamborg et Phillips (1995): anorganický dusík a draslík NO3- K* 30 mM amonné soli NH4+ 2-20 mM sulfáty, fosfáty, vápník a hořčík SOAz- P043- Ca2+ Mg2+ 1-3 mM Dusík hlavní složkou všech médií je anorganický dusík používa se ve dvou formách: • dusičnany (nitráty) • amonné ionty KNO3, NH4N03, Ca(N03)2.4H20 Dusičnany (nitráty) • mohou být transportovany xylemem do jiných částí rostliny, kde probíhá jejich asimilace • nemohou být použity k syntéze organických molekul přímo, ale musí být postupně redukovány napřed na dusitany a pak až na amonné ionty • mohou být skladovány ve vakuolách buněk a plní důležitou funkci osmoregulace a rovnováhy mezi kationty a anionty Asimilace dusičnanu 1. krok - konverze nitrátu na nitrit nitratrcduktaza (v cytoplazme) katalyzuje přenos c- z NAĎPH FAĎ —► cytochrom Fe (II/III) —► —► Mo (V/VI) —► NO3V N02- 2. krok - redukce nitritu na čpavek nitritrcduktaza (v plastidech) katalyzuje redukci N02- Wl-^ elektrony pro tuto redukci se získávají ve fotosystemu I, přenašečem je feredoxin Amonné ionty • volný čpavek nebo amonné ionty jsou pro rostliny toxické i v nízkých koncentracích (inhibice tvorby ATP) • jsou rychle převáděny na nízkomolekulární organické sloučeniny (glutamin, glutamát, asparagin, arginin, alantoin...) • skladování v kořenech rostlin a zásobních orgánech Fosfor • je přijímán jako dihydrogenfosforečnan • může být přítomen v rostlinách jako anorganický fosfát (Pi), po vstupu do cytoplazmy je rychle ester if i kován na ATP • je nezbytný - pro stavbu DNA, RNA, f osf o lipidů biomembrán - pro energetický metabolismus - energie uvolněná glykolýzou nebo získaná fotosyntézou nebo oxidatívni f osf orylací se ukládá do ATP a může být později uvolňována hydrolýzou na AĎP a na Pi Draslík • má velkou pohyblivost - na buněčné úrovni i na dlouhé vzdálenosti ve f loému a xylému • je iontem s nejvyšší koncentrací v buňce (100 - 200 mM v cytoplazmě) • význam pro osmoregulaci • funguje jako protiváha při udržování optimálního pH • aktivuje mnoho enzymu (vazba K+ indukuje konformační změny proteinů), aktivuje rovněž membrány pro vazbu ATPáz Vápník • většinou vázán na buněčné stěny (Ca pektáty) a buněčné membrány • transport Ca2+ f loémem i z buňky do buňky je velmi omezený • Ca2+ velmi ovlivňuje stabilitu buněčné membrány interakcí s fosfáty, karboxylovými skupinami fosfolipidů a proteinů • vazebný protein vápníku kalmodulín - role v regulaci intracelulární koncentrace Ca2+ Hořčík • velmi mobilní, schopný tvořit komplexy • je nezbytný - pro četné enzymatické reakce - fotosyntéza - regulace pH a rovnováhu iontů - syntéza proteinů (tvoří mostek mezi podjednotkami ribozomu ), při nedostatku hořčíku se podjednotky rozpadnou a proteosynteza je zastavena - energetický metabolismus Mikroelementy používají se mikromolární koncentrace mají význam především jako kofaktory bór B chlór, jód CI,I železo Fe kobalt Co měď Cu mangan Mn molybden Mo zinek Zn Organické sloučeniny - „vitamíny" • BI thiamin • B6 pyridoxin • kyselina nikotinová (biotin, kyselina listová, Ď, pantotenát vápenatý...) • myo-inositol - stavební jednotka inositolf osf atidS, role pri tvorbe a metabolismu membrán, u rostlin i fytinová kyselina = se 6 zbytky kys. fosforečné Organické sloučeniny uhlíku sacharidy • metabolízovatelne cukry = organická forma uhlíku - sacharosa - glukosa - fruktosa • nemetabolízovatelne cukry = změny osmotícke hodnoty média - manitol - sorbitol Dusíkaté organické sloučeniny - aminokyseliny • směsi - kvasničný hydrolyzat („yeast extract") - hydrolyzat kaseinu (aminokyseliny mléčného proteinu) • čisté aminokyseliny (L-formy) L-glycin Dusíkaté organické sloučeniny - polyaminy putrescin spermidin spermin mají nejen funkci nutriční, ale hlavně regulační: podpora tvorby adventivních kořenů podpora tvorby prýtů podpora somatické embryogenéze Ztužování médií • agar - polysacharid extrahovaný z různých druhů mořských ras (často obsahuje velké množství solí) • karagenan - polysacharidy z ruduch, po ochlazení tvoří dvojitý helix v přítomnosti kat iontů (Kappa typ tvoří gel v přítomnosti K+, lota typ geluje v přítomnosti Ca 2+) • Gelrite® - přírodní polysacharid produkovaný mikrobiální f ermentací (glukosa, glukuronová kyselina, glukosa a rhamnosa). Poskytuje pevný průhledný gel v přítomnosti Mg 2+, Ca 2+. Používá se v poloviční koncentraci ve sro\/r\ár\\ s agarem • alginát sodný - směs polyuronových kyselin, extrahován z hnědých řas. Tvoří zastudena gely rozpustné vodou, geluje v přítomnosti Ca 2+ Plant Biotechnology - Sigma Aldrich http://www.sigmaaldrich.com/Arca_of_Intcrcst/Lifc_Scicncc /Plant_Biotechnology/Tissue_Culture_Protocols. html The Plant Tissue Culture Protocols are part of Sigma's growing offer in Plant Biotechnology. We have added helpful information in each protocol including: Media Preparation Media Formulation Sterilization Techniques Storage Plant Biotechnology - Sigma Aldrich Plant Tissue Culture Protocols Antibiotics Gelling Agents Murashige and Skoog Media Variations Phycology and Aquatic Plant Media Plant Pathology Media Silver Thiosulfate Solution Sunbag Vessels Classic Plant Media Iron Chelate Solution Orchid Culture Media Plant Growth Regulators Plant Tissue Culture Media Sterilization of Culture Media Vitamin Mixtures Surface Sterilization of Plant Explants and Orchid Seed Nejčastěji používaná média Murashige et Skoog (1962) AAS Gamborg, Miller et Ojima (1968) B5 Schenk et Hildebrandt (1972) SH White (1963) Nitsch (1951), Nitsch et Nitsch (1967) Lloyd et AAcCown (1981) WPAA Kao et AAichayluk (1975) Chu (1975) N6 http '-//www. hos. uf I. edu/mooreweb/TissueCulture/tcclass. htm Murashige - Skoogovo základní médium (1962) Inorganics (mg/L) M0404 Potassium nitrate 1900.0 Sodium nitrate 1751.0 Ammonium nitrate 1650.0 Magnesium sulfate 180.7 Potassium phosphate monobasic 170.0 Calcium chloride anhydrous 332.2 Na2-EDTA 37.26 Ferrous sulfate • 7H20 27.8 Cobalt chloride • 6H20 0.025 Cupric sulfate • 5H20 0.025 Boric acid 6.2 Manganese sulfate • H20 16.9 Molybdic acid (sodium salt) • 2H20 0.25 Potassium iodide 0.83 Zinc sulfate • 7H20 8.6 Vitamíny podle Gamb Organics (mg/L) myo-Inositol Nictotinic acid (free acid) Pyridoxine • HCl Thiamine • HCl a AA 0404 100.0 1.0 1.0 10.0 Příprava živného média (1 I) 6,5 g agaru vsypeme do 300 ml destilované vody v SIMAX láhvi a rozvaříme v autoklávu do Erlenmeyerovy baňky odměříme 500 ml destilované vody. nebo navážíme 4 413 mg sypké směsi: Murashige-Skoogovo médium s vitamíny podle Gamborga (Ďuchefa) navážíme 20 g sacharózy Příprava živného média (1 I) podle potřeby doplníme další látky jako aktivní uhlí, růstové regulátory a pod. slijeme rozvařený agar s roztokem v EM baňce a doplníme v odměrném válci na 1000 ml pomocí Phan papírků změříme pH a upravíme na 5,7 pomocí 0,1 M KOH nebo 0,1 M HCl médium dobře promícháme přeléváním z válce do EM baňky a rozlijeme asi po 40 ml do kultivačních nádob Příprava živného média (1 I) kultivační nádoby s médiem uzavřeme vhodným uzávěrem následující den sterilizujeme při 121°C v autoklávu po dobu 20 minut (médium s přídavkem aktivního uhlí při chladnutí promícháváme) krátkodobě média uchováváme při laboratorní teplotě, při skladování po delší dobu používáme lednici při kultivaci v Petriho miskách rozléváme médium sterilně v očkovacím boxu až po jeho sterilizaci