OpylováníOpylování in vitroin vitro Test-tube pollination/fertilization Pulsatilla grandis, Brno Stránská skála, 6.4.2003 Rozmnožování u rostlin vegetativní rozmnožování (amixis) fragmentace cibulky, hlízky rhizomy generativní rozmnožování (amfimixis) specializované struktury - vývoj pohlavních buněk + mechanismus zajišťující jejich fůzi apomixis - zvláštní varianty rozmnožování ,,vegetativní množení z generativních orgánů" semena jsou tvořena bez oplození Fáze životního cyklu u rostlin * Životní cyklus = střídání fází = rodozměna * Sporofyt - 2n - diploidní generace produkující haploidní spory * Gametofyt - 1n - haploidní generace produkující samčí nebo samičí pohlavní buňky (gamety), jejichž splynutím vzniká diploidní zygota Rodozměna u mechorostů oplození Meiosis embryo i zralý sporofyt jsou závislé na fotosyntéze gametofytu Gametofyt S 1n 1n 1n 1n 1n 1n 1n 2n 2n 1n Rodozměna u kapradin Meiosis oplození GS sporofyt i gametofyt je schopný fotosyntézy prokel Rodozměna u krytosemenných rostlin http://zygote.swarthmore.edu/phyto1.html Meiosis Oplození zár. vak osemení endosperm embryo klíčení semene Sporofyt 2n koruna semeník vajíčko Mikrosporang. 2n Mikrospory 1n Megasporang. 2n Mitosis Megaspory 1n pyl samčí gametofyt zár. vak samičí gametofyt láčka prašník gametofyty jsou velmi redukované a rodozměna je tak zastřena Gametofyty jsou závislé na fotosyntéze sporofytu Sporofyt G Meiosis oplození Funkce generací při oplození u krytosemenných rostlin sporofyt tvoří: struktury chránící a vyživující gametofyt struktury pro zachycení a rozpoznání pylu struktury umožňující ochranu a rozšiřování semen gametofyt = tvořen malým počtem silně specializovaných buněk: zárodečný vak s jedinou vaječnou buňkou pylová láčka se dvěma spermatickými buňkami Schéma stavby květu a prašníku vajíčko kalózová zátka p.láčka Schéma gynecea s vajíčkem pylové zrno blizna čnělka semeník pestík = soubor plodolistů = gynaeceum Místa interakcí v pestíku Povrch pylového zrna: pylový tmel proteiny ve sporodermě Bliznový exudát Tekutina kanálu čnělkyTekutina kanálu čnělky Placentární tekutina Exudát mikropyle Willemsee (Haworthia) Bariéry oplození * vnější ­ nepřiměřená teplota a vlhkost ­ nedostatečná výživa ­ působení fyzikálních nebo chemických vlivů * vnitřní prezygotické ­ inkompatibilita ­ inkongruita (nedostatek informace a koordinace) ­ samčí nebo samičí sterilita postzygotické - malformace vývoje endospermu - bariéry klíčení embrya Inkompatibilita (neslučitelnost) * neschopnost rostlin tvořit semena, přestože mají funkční gamety * před 200 lety - Kölreuter - Verbascum - po samoopylení netvořila semena, zatímco po cizosprášení ano * Stout (1917) - studium fertility Cichorium intybus Typy inkompatibility * vnitrodruhová (autoinkompatibilita) * heteromorfní (distylie, tristylie) * homomorfní ­ sporofytického typu ­ gametofytického typu * mezidruhová * mezirodová Funkce inkompatibility * zabránění samoopylení ­ podporuje cirkulaci genů v populaci * zabránění mezidruhovému nebo vzdálenějšímu (mezirodovému) křížení (zábrana ,,gene flow") - podporuje stabilitu druhu Nettancourt et Devreux 1977 Inkompatibilita sporofytického typu * je daná genotypem rostliny, která produkuje pyl (sporofytem). Bez ohledu na genotyp si pyl ponechává fenotypovou reakci dominantní alely * projevuje se již na povrchu blizny (proteiny z tapeta) * suché blizny a 3 buněčný pyl Inkompatibilita gametofytického typu * je určována genotypem samotného pylového zrna (gametofytu) * projevuje se až při prorůstání pylových láček přes pletiva čnělky a zárodečného vaku zastavování růstu pyl. láček * vlhké blizny ­ u čeledí Viciaceae, Solanaceae Inkompatibilita gametofytického typu sporofytického typu tyčinka S1/S2 tyčinka S1/S2 pestík S2/S3 pestík S2/S3 pestík S2/S3 pestík S2/S3 pyl pyl S1 S2 S1 S2 Překonání inkompatibility umělé opylováníumělé opylování in situin situ opylováníopylování in vitroin vitro Umělé opylování in situ * opylení nezralých blizen * teplotní šoky * ovlivnění blizen (organická rozpouštědla, růstové regulátory, vitamíny, cukry, extrakty z kompatibilních blizen, ,,mentor pollen") * odříznutí blizny a čnělky * intraovarijní opylení * transplantace blizen Umělé opylování in situ normální opylování odříznutí blizny a čnělky opylování opylování opylování transplantace blizny a čnělky embrya nebo semena embrya nebo semena embrya nebo semena opylování směsí pylu (,,Mentor pollen") bez embryí nebo semen Opylování in vitro 1. intraovarijní - pyl v suspenzi 2. bliznové 3. placentární 4. izolovaná vajíčka 5. oplození izolovaných gamet Předpoklady úspěchu * znalost vhodného vývojového stadia * zajištění média pro klíčení pylu i vývoj embrya Intraovarijní opylování in situ * Capelleti (1937) Digitalis * Bossio (1940) Helleborus, Paeonia * Dahlgren (1926) Codonopsis * Kanta (1960) Papaver, Escholzia * Niemirowicz-Szcytt et Kubicki (1979) Cucurbita x Cucumis opylování in vitro bliznové opylování placentární opylování Johri 1984 Bliznové opylování in vitro * Usha (1965) Antirrhinum * Balatková et Tupý (1973) Antirrhinum * Dulieu (1966), Rangaswamy (1972) Nicotiana * Sladký et Havel (1976), Gengenbach (1977), Raman (1980) Zea * Uralec (1981) Lycopersicon Placentární opylování in vitro Kanta (1960) Papaver Zenkteler (1965) Dianthus, Melandrium, Silene Balatková et Tupý (1968) Nicotiana, Narcissus Zůbková et Sladký (1975) Nicotiana, Papaver, Agrostemma, Melandrium Sladký et al. (1982) Chionodoxa Segment placenty máku 1T po izolaci a opylení in vitro Podmínky pro opylování in vitro * semeníky mají velký počet vajíček (Solanaceae, Papaveraceae, Silenaceae) * minimální poškození vajíček při izolaci * životaschopný pyl, klíčivý * masivní růst pylových láček * znalost receptivity Klíčící pyl Galanthus nivalis in vitro pylová láčka pylové zrno Podmínky pro opylování in vitro * znalost času anthesis * znalost dehiscence prašníků * informace o klíčení pylu a rychlosti růstu pylové láčky * životaschopnost a receptivita vajíček Opylování izolovaných vajíček * Kameya (1966, 1970) Brassica * Chi (2000) Lilium Opylování izolovaných vajíček CHI (Bot. Bull. Acad. Sinn. (2000) 41: 143 - 149 detail mikropyle s pyl. láčkami (c) pylové láčky v mikropyle (b) a synergidách (c) a b c a = vajíčka b = pyl.láčky c = pyl a b c Oplození izolovaných gamet Zea (Kranz et Lörz, Univ. Hamburg) Izolované a spojené buňky zárodečného vaku kukuřice: vaječná buňka (E), centrální buňka (CC) a dvě synergidy (SY) enzymatická izolace buněk zárodečného vaku http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/kranz/1996.htm Oplození izolovaných gamet centrální a spermatická buňka kukuřice vlevo: spermatická buňka (S) a centrální buňka (CC) připojené na jednu elektrodu před fůzí buněk vpravo: jádro spermatické buňky (SN) uvnitř in vitro oplozené centrální buňky, barvení DAPI 1 hod. po fůzi buněk, pozorováno epifluorescenčním microskopem, (V) velká vakuola. (Kranz et al., 1998) Oplození izolovaných gamet kukuřice splývání jader (Univ. Hamburg) Izolované jádro cenrální buňky kukuřice s integrovaným jádrem spermatické buňky (SN). Karyogamie po 150 min po in vitro fůzi spermatické a centrální buňky. (N) velké jadérko. Světelná/epifluorescenční mikroskopie po DAPI barvení (Kranz et al., 1998) Oplození izolovaných gamet primární endospermální buňka kukuřice (Univerzita Hamburg) primární endospermální buňka kukuřice vytvořená in vitro po 1 dnu kultury (Kranz et al., 1998) Oplození izolovaných gamet endosperm kukuřice po 5 DK (Univ. Hamburg) Feulgenovou reakcí barvené buňky endospermu kukuřice vytvořené in vitro po 5 dnech kultury. (Kranz et al., 1998) Oplození in vitro u kukuřice Sperm cell Egg cell Okamoto Brno 2003 oplození vývoj embrya Syngamy 1 sec Karyogamy 35-90 min Cell Wall Formation 30 sec 0 10 20 30 40 50 60 Time course of the early events of in vitro zygote development in maize, Okamoto, Hamburg (Brno 2003) 0 0.5 1 3 6 12 24 36 (h after fertilization) First Cell Division 40 ­ 50 h Mikromanipulace se samičím gametofytem pšenice, Barnabas, Maďarsko (Brno 2003) Imobilizace vaječné buňky s použitím elektrického proudu Mikroinjekce DNA do imobilizovné vaječné buňky vaječná buňkasynergida Mikrochirurgická izolace