Embryogenéze = vývoj embrya m situ 1. zygotická 2. somatická j/i vttro Vývoj embrya Nahosemenné rostliny (Gymnospermae) Pinophyfa bohatě rozvetvené stromy (vzácnej i keře) * většinou s jedním monopodiálním kmenem * sekundární xylém bohatě vyvinutý * boční větve často uspořádány patrovitě * možná diferenciace na makro a brachyblasty listy převážně jehlicovite nebo šupinovité * u primitivních t^pů ještě vidlicnate rozvětvené, později * redukované nedělené a páskovité, jehlicovite nebo šupinovité původněve šroubovici, později též v přeslenech nebo vstřícné, případně ve svazečcích na brachyblastech pryskyřičné a siličné kanálky ve dřevě a v listech * schizogenního původu, různá distribuce Evoluce reprodukčních Samčí orgány -mikrosporofyly jednoduché i složené Samicí orgány (šiška) -makrosporofyly redukce počtu vajíček obrácení přímých vajíček (mikropyle k primární ose) vznik bilaterálně souměrné semenné šupiny zploštěním sekundárního výhonu a semen organu jehličnanu Pseudovolzia Vývoj samčích gamet mikrospora 1. prothaliová buňka meristem. iniciála 2. prothaliová buňka antheridiální iniciála nahosemenné rostliny generativní buňka spermatogenni buňka _____body cell_____ sterilní buňka stalk cell samčí gameta samčí gameta Samčí gametofyt vývoj: mikrospora => pylové zrno: Sterile cslJ prothaliove buňky (různý počet) Spenratogenous cen - (0-) 2 (až 40 u Araucaria) láčková buňka (vegetativní) generativní buňka =$ sterilní buňka (stopková) => spermatogenní buňka Pinus 2 samčí gamety ProthaífiaJ ceľs ----------v Tube cell Generative eeí< Wina rpŠL *'rv íl«? hi f*. «Mi Wing i*^ Samici gametofy vzniká z mateřské buňky zárodečného vaku (megaspory) mnohobuněčné prothalíum s několika archegonii (1 - 2 - 6; Sequoia až 60) pylová láčka ygoty tnegagainetofyt fúzující jadra oosféry a buňky sperrnatické oplození t (zárodečný vak) Integument Nucelíus Archegonia Female gameíophyte Pinus Oplození = * * u recentních typů pylovou láčkou a nepohyblivými spermatidami (siphonogamie) u nejpůvodnějších fosilních typů snad ještě spermatozoidy * * obvykle oplodňuje jen jediná spermatida * druhá (menší) zaniká často trvá velmi dlouho (rok a více) ednoduché ■-'""■'■^■■iji Oplození a vývoj embrya Maturation of seeds Pinus obvyklý průběh Fertilization —late spring or early summer 1974 Embryogeny (continued) Meiosis-spring 1973 Initiation of S and ? gametophytes —spring 1973 Embryogeny begins-summer 1974 Embryogeny (continued) Embryogenéze u Pinus pylová lá spermat jádro fúzující jadra oosféry a buňky spermaticke proernbrya rnegagarnetofyt oplození Raven P.H. et al. Biology of Plants. 2005 ibytky If. stonkový meristém kotyl semeno Wardlaw C.W.: Embryogenesis in Plants. 1955 Podélný řez semenem modřínu Larix dexidua (L.)MILL. zbytek nucelu dělohy SAM hypokotyl embryo haploidní megagametofyt („primární endosperm") kořenová čepička parafínový řez, barveno Heidenheinovým hematoxylinem (osemení odstraněno před procedurou) Embryogenéze z oplodněného vajíčka vzniká zpočátku proembryo a teprve z něj pak jedno nebo více embryí (různé u různých čeledí a rodů) • embryo má často mnoho děloh (ale někdy též jen dvě) Rozšiřování semen - převážně anemochorie - vzácněji i endozoochorie Abies alba Srovnání zygotické a somatické embryogenéze u Pinus faeda suspenzní kultura zrání embryí na pevném médiu zygotická embrya somatická embrya Pí Ihi-ni GS.etalP&itCelIrep. 21 (2D[J^i:717^753: Mikropropagace konifer z izolovaných zygotických embryí Picea 14 DC BA Picea Larix Vývoj embrya = embryogenéze Krytosemenne rostliny (Angiosperms) Makrosporogeneze = tvorba makrospor samicí archespor J makrosporocyt Meióza 1,11 tetrada haploidních makrospor Makrogametogeneze = tvorba zárodečného vaku tetráda haploidních makrospor .. 1 fungující makrospora (makrospory) mitoticka dělení mladý zárodečný vak diferenciace buněk zralý zárodečný vak = samicí gametofyt monosporický, bisporický, tetrasporický Zárodečný vak typu Polygonum functional megaspore coenocytic phase Bioassays 28:1067-1071, 2006 Anatropní vajíčko - schema .■■ T*?" -'-l-i-At^^. nuclei :n: ^ h L ů£ů'í Micrüpylc -Antipodal ■ Integuments 1 ) f I v ľ_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Základní typy vajíček krytosemenných rostlin Goebel 1933 přímé obrácené pncne ortotropní anatropní hemitropní kampylotropni amfitropní (atropní) 38 Embryogenéze = vývoj embrya Rostlinné embryo je charakterizováno svým původem, svou morfologií a svým vývojem v čase. Původ: zygotická embrya vznikají ze zygoty, která je výsledkem fůze gametických buněk - zárodečný vak somatická embrya (syn. asexuální embrya, adventivní embrya, embryoidy) se vyvíjejí ze somatických buněk Morfologie: plně vyvinuté embryo je bipolární struktura se stonkovým meristémem na jednom konci a kořenovým meristémem na konci druhém; dále je charakterizováno specifickým typem listů, tzv. dělohami. Vývoj embrya v čase je charakterizován sledem typických morfologických stadií zygota globulární embryo srdcovité embryo hruškovité (torpédovité) zralé embryo Modelové rostl ir Capsella bursa-pastoris L. http: //botit. botany. wise. cdu z čeledi Brassicaceae Arabidopsis t hal i ana (L.) Heynh. olistěná lodyha (Painting by Janet Wehr, courtesy of Chris Somcrvillc) Embryogenéze Capsella bursa-pastoris zygota "i® lineární embryo g|obu|ápní embpyo suspenzor globulární embryo srdcovite embryo hruškovité (torpedovite) embryo Erdelská 1981 Poddubnaja- Arnoldi 1976 Copse I/o bursa-pastor is - globuldtrni embryo torpedovite embryo vývojová stadia embrya starší torpedovite zralé embryo embryo http: //botit. botany. wise. cdu Stadia embryogenéze Arabidopsis thai i ana http://people.whitman.edu/^vernondm/index.html Preglobular Stage o apical cel fertilized basal cell egg Mature Embryo em bryo .. - ■ v // 'S Globular Staqe f^r------^ '^ ■'■■■■ ) J %&l Vl Heart Stage J Torpedo Stage Mature Embryo cotyledons shoot apical rneristern epidermis seed ooat cotyledons hypoootyl— root- Image adapted from Wolpert, Lewis. (1998) Principles of Development. Oxford University Press, NY Embryogenéze Arabidopsis 1 preglobulární 2 globulární 3 srdcovité 4 torpédovité DM Vernon and Ď Mcinkc (1994) Ďev. Bio/. 165: 566-573. Photos by DM Vernon Nomarski OIC Kultivace izolovaných zygotických embryí historie aplikace Historický přehled Bonnet (1754) - klíčeni zárodků fazolu zbavených děloh Sachs - 19. stol.- špatné klíčeni embryí bez endospermu van Tieghem - pěstování izolovaných embryí na rozetřeném endospermu jiného druhu Brown a Morris (1890) - transplantace embryí ječmene do endospermu pšenice Hannig (1904) - nezralá i zralá embrya Raphanusa Cochlearia Knudson (1920 - 1930) rostliny ze zárodků Orchidaceae -kultivace na agarovem médiu s cukrem bez symbiotických hub Dietrich (1924) - možnost zkrácení dormance Historický přehled Raghavan - experimentální embryológie Torrey Monnier - izolace globulárních embryí Capsella Norstog - kultivace embryí obilovin Preťová - izolovaná embrya lnu Rangaswamy Bajaj Zenkteler - využití překování aborce embryí po opylení in vitro Semeno a embryo fazolu Phaseolus vulgaris L. osemeni (testa) cikatrikula semenná jizva pupek = hilům plumula apex+pravé listy děloha (kotyledon) hypokotyl radikula Kultura izolovaných embryí aseptické vyjmutí embrya a jeho přenos do vhodného média a optimálních kultivačních podmínek • relativní snadnost získání embryí bez patogenu (povrchová desinfekce semen nebo plodu) • semena s tvrdým osemením - měkčení vodou, pak opakovaná desinfekce • podmínka nutná pro vývoj izolovaných embryí = nepoškození embrya (suspenzor) - preparační mikroskop • výběr média - čím mladší embryo, tím větší nároky Použití kultur izolovaných embryí • překonání dormance semen • prekonaní aborce embryí („embryo rescue") po křížení in situ nebo in vitro mezídruhove hybridy: bavlník, ječmen, rýže, juta, mezírodove hybridy: Hordeum x Secale, Triticum x Secale, Hordeum x Hordelymus, Tripsacum x Zea • monoploidní ječmen • studie experimentální embryogenéze • zdroj mladého materiálu pro mikropropagaci Prekonávaní aborce embryí po opylování in vitro 9 MC Papaver 35 ĎC Galanthus 60 ĎC aggie - horticulture. tamu. edu/f acuity/ king/Tissue_Culture_Lecture. ppt Bulbosum Method of Haploid Production Hordeum vulgare ječmen obecný 2n = 2X = 14 X Hordeum bulbosum planý ječmen 2n = 2X = 14 Embryo Rescue haploidní ječmen 2n = X = 7 eliminace chromosomů H. bulbosum zdvojení chromosomů mezidruhový hybrid Hordeum vulgare homozygotní ječmen 2n = 2X = 14 dříve mnohem účinnější metoda pro tvorbu haploidních rostlinek než mikrosporové kultury (ale použití jen u ječmene) nyní, při použití zlepšeného složení média (sacharosa nahrazena maltosou), je mikrosporová kultuře mnohem účinnější (~2000 rostlin ze 100 prašníků) Príklady získaní alopolyploidu Trificum durum (pšenice) 2n = 28 AABB x I Secale cereale (žito) 2n = 14 RR izolace embrya haploidní hybrid 2n = 21 ABR .1 vysoce sterilní zdvojení chromosomu Trificale 2n = 42 AABBRR mezidruhový hybrid aggie - horticulture. tamu. cdu/f acuity/ king/Tissue_Culture_Lecture. ppt V. Raghavan 1 • Kultivace izolovaných zralých embryí C.. Kultivace proembryí „in ovulo embryo culture" opyleni a oplození kultura embryí Embryo and ovary culture regenerace 10 DAP regenerace ■----------------------------------> 30 DAP Lammerts van Bueren etol., Luis Bolk Instituut Kultivace izolovaných embryí konifer {Picea, Pinus) • povrchová desinf ekce semen • bobtnání semen ve sterilní destilované vodě pres noc • opakování povrchové desinf ekce semen • sterilní izolace embryí • inokulace embryí na povrch agarem ztuženého média M-S s přídavkem auxinu a cytokininu (IF), kontrola M-S (1). Stavba embrya kukuřic endosperm (Zea mays L.) perikarp (oplodí + osemení) štítek (scutellum) koleoptile plumula rad i ku I a koleorhiza http: //botit. botany. wise. edu embryo Izolace a kultivace embryí kukuřice (Zea mays L.) povrchová desinfekce obilek bobtnání obilek ve sterilní destilované vodě 6 hod. opakování povrchové desinfekce semen sterilní izolace embryí inokulace embryí na povrch agarem ztuženého média M-S. hodnocení experimentu - rychlost růstu klíč nich rostlin (délka kořenů a prýtů) Somatická embryogenéze definice, historie objevu iniciace využiti Somatická (adventivní) embryogenéze vývoj bipolární struktury embryonálními stadii bez fůze gamet 1. spontánní SE in vivo somatická pletiva - kapradiny, orch\de]e,Kalanchoe reprodukční pletiva - Citrus, Mango 2. indukovaná SE in vitro nepřímá - přes stadium kalusu přímá - meristémy, zygoticka embrya, klíč ní rostliny Totipotence somatických buněk Každá buňka obsahuje celou sadu genetických informací, které jsou nezbytné k vytvoření celé rostliny. Časová a prostorová exprese genů je přesně regulována, aby došlo k diferenciaci různých orgánů. Indukce SE musí sestávat z ukončení exprese genů vedoucích k diferenciaci orgánů a jejich nahrazení programem embryogenních genů („přepnutí morfogenetickeho programu") auxiny 2,4-D picloram Co víme o somatické embryogenezi Základní požadavky jsou obecně platné jako pro zygotickou embryogenezi = regulace dělení buněk a diferenciace pletiv Požadavky na indukci somatické embryogenéze: • kompetentní buňky • vhodné prostředí • stimul Somatic embryogenesis --------> leať cuttings on culture medium callus growth v$m callus culture single callus formation somatic embryos (shoots) embryo regenerated plant Lammerts van Bueren etol., Luis Bolk Instituut Rozdíly mezi přímou a nepřímou SE (Sharp et al. 1980) přímá SE - embryogenní buňky jsou již přítomny na explantatu = pre-embryogenně determinované buňky (PEDC), které potřebují pouze vhodné podmínky, aby došlo k expresi embryogenéze nepřímá SE - napřed musí dojít k redeterminaci diferencovaných buněk = prolif erace kalusu a v něm u části buněk se uskuteční indukce embryogenně determinovaného stavu (IEĎC) Somatická embryogenéze Somatická embryogenéze in vivo- buňky samicího gametofytu (citrusy - vývoj adventivních embryí, ale dokončený vývoj jen při vtlačení do zárodečného vaku... 1-40 embryí v semeni) Somatická embryogenéze in vitra vývoj embryí ze somatických buněk posloupností morfologických změn obdobných těm při vývoji zygotickeho embrya. U některých rostlin: všechna pletiva, u jiných jen některá pletiva responsivní (mrkev X obilniny, reproduktivní pletiva) 1993 - 123 druhů Z 56 Čeledí a 81 rodů organogeneze sómat, embryogenéze 1995 -1000 druhů SE in vitro Použití : > Studium zárodečného vývoje rostlin \ i > Množení rostlin Unipolární útvar, spojení Bipoldrní útvar, izolace s mateřským pletivem 0d mateřských pletiv Jednobuněčný versus mnohobuněčný původ SE Haccius (1978) SE - nová individua vznikající z jedné buňky a jsou bez spojení s cévními svazky materského pletiva Raghavan (1976) a jiní mnoho případů, kde zjevně bipolární embryoidy vznikly z agregátů buněk Maheswaran et Williams (1985) - u přímé SE existuje gradient spojený s postupnou diferenciací pletiv Původní představa totipotence: Všechny buňky mají jádro =^ jsou totipotents * %%\ >ť indukce =^ vytvoření nového jedince t«*^ Totipotence buňky nestačí, buňka musí být kompetentní ?? Proč nejsou všechny buňky kompetentní ? Důvody > genetické > epigenetické > fyziologické fyziologie rostlin UK Praha ?? Proč postupně nereagují všechny buňky ? > vymizení gradientů > vyčerpání živin > interakce zdroj/sink fyziologie rostlin UKTraha Signál Morf ogeneze in vitro Izolace explantatu Signál Kompetence Neorganizovaný rust Růst meristematických center Determinace Organizace Izolace, poranění změna prostředí Nové gradienty Nové vztahy Rediferenciace Organogeneze unipolární struktury Embryogenéze bipolární struktury Vztahy dějů při morfogenezi Totipotence signál fyziologie rostlin UK Praha Kompetence M' Signál Determinace Hlavní problém = poznání charakteru příslušných signálu v praxi obtížné => často empirický přístup Totipotence x kompetence x indukce x determinace Somatická embryogenéze smrku ztepilého Iwáace -> Proliferace^ Zrání + Oesikace -> Klíčeni Proliferace: 5 j/M 2,4-Ď, 2 ^M KIN, 2 j/M BAP; Zrání: bez auxinů a cytokininů, 20 /l/M AB A Zrání somatických embryí 1. týden 2. týden 150 jim Rané somatické embryo 200 Mm Cylindrické stádium 3. týden 4. týden - £3&4ť b» *J ■ • #•' - - 'i^H ! .L *■. ' Ä*] 200 jim 200 Mm Prekqtyledonární stadium Proliferace embryogenní kultury ■■''., J ■ •■ ■' ^ ... ' "H 5. týden 6. týden 500 fim 500 jim Kotyledonární stádium fyziologie rostlin UKPraha Produkce somatických embryí odvozených od kořenových explantátu mrkve Steward et al. Science, 143, p. 20-27,1964 Somatic embryogenesis of Daucus carota: standard protocol (Ammirato, 1983) Place 0.5-1 cm petiole explant or 0.5cm3 storage root explant on MS agar medium + 4.5 ÜM 2,4-D After 4 weeks growth (dark or lighted) there is enough callus Subculture every 14-18 days Erlenmeyers are placed on a gyrotary shaker and maintained at 25°C and Subculture 2.0 -3.0 g of callus into 50ml of MS liquid medium + 4.5 ^lM 2n4-D contained in a 250 nil Erlenmeyer flask Aseptic ally aspirate and/ or decant the stale medium and re suspend the cells onto culture medium devoid of 2,4-D for initiation of embryo development agitated 125-1Ö0 rprn Awftftft^ww^ftft^ww.í.| ^vvvvvvv^^^vvvvvvvw.;.;.;.;.;.1. Pass the pro embryo suspension through a senes of mesh sieves for a uniform embryo population. Transfer the washed and sieved suspension For more normal development to 50ml of MS basal medium in Erlenmeyers. For more normal embryo development and to inhibit precocious germination, especially root elongation, 0.1-1 llM ÁBÁ can be added cultures should be grown in darkness. Embryos should appear in about 8 days and reach mature size in 10-15 days Í4 Somatic embryos can be placed out on agar medium devoid of 2,4-D for plantlet development TvT \ w Plantlets are transferred to Jiffy pots or verrniculite for subsequent development Vývojová stadia somatických embryí globulární srdcovité torpcdovitc kotyledonární http://www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/IM&00003.ôIF Nepřímá somatická embryogenéze somatická embrya Aesculus hippocastaneum odvozená z květenství ■HHH^^HBM^H^M Nepřímá somatická embryogenéze na kalusu Inu Somatická embryogenéze u dřevin *T*, »i Sitka spruce (Picea sifchensis) (Photo: Ďr. P. Krogstrup) Zrání somatických embryí a desikace • Předčasné klíčeni = torpedovite embryo pokračuje v růstu do klíč ní rostlinky bez fáze dozrávání = chybí zásobní látky a tolerance k vyschnutí • Akumulace zásobních proteinů • Nárůst obsahu kyseliny abcisové Umělá semena Syntetická nebo umělá semena jsou jednotlivá enkapsulovana somatická embrya. Termín 'emblíng' se často používá pro označení rostlinek pocházejících ze somatických embryí nebo syntetických semen. Na-alginát se často používá pro enkapsulaci embrya. Byly vyvinuty rovněž speciální gely, které se samovolně rozkládají. Limitující faktory pro širší použití a tvorbu umělých semen ve větším měřítku*. • kvalita a pravidelná tvorba somatických embryí • konverze embryí Příprava umělých semen 2% LF Alginate sert embryo into drop Complex in 100 niM calcium nitrate for 20 minutes Wash capsules in water for 5 minutes Uměla semena embryo enkapsulované v alginátu sodném Problémy: nepravidelnosti utváření SE (embryo často nedokonale vyvinuté, absence meristemu, velké interceluláry, absence zásobních látek a ABA) konverze Somatická embrya sóje enkapsulovana v alginátu Ďr. 6riga, Agritec s.r.o. http://people.whitman.edu/-vernondm/embryo/plant.html embryogenéze Arabidopsis http://bibd.uni-giessen.de/ghtm/2000/uni/p000004.htm somatická embryogenéze a biotechnologie http://wwww.cirad.fr/presentation/programmes/biotrop/result ats/biositecirad/es.htm somatická embryogenéze - kaučukovník, rýže, banánovník apod. http://www.botanic-garden.ku.dk/eng/forskning/vaev2.htm somatická embryogenéze -jehličnany Otázky pro další výzkum 1. Co je podstatou konstituce embryogenní kompetence na buněčné a molekulární úrovni? 2. Jak jsou embryogenně kompetentní buňky produkovány během ontogeneze rostlin? 3. Molekulární organizace programu somatické embryogenéze a její realizace 4. Jaká je povaha stimulu, který indukuje program embryogenéze u kompetentních buněk? Kultivace drevokazných hub Příklad suspenzní kultury • uchování čisté kultury mycelia na šikmém agar-sladu (pasáž lx ročně) tma, 4°C • nárůst hmoty mycelia - Petři ho misky s agar-sladovým médiem termostat, tma, 25°C • pasáž mycelia na povrch skleněných perel s 3% sladem termostat, tma, 25°C • roztřepání mycelia a inokulace do 3% sladu třepačka, 25°C • inokulace substrátu nasyceného 3% sladem termostat, tma, 25°C • indukce tvorby plodnic chladový šok Kultivace drevokazných hub Lentinus tigrinus - houzevnatec tygrovaný (1) Pleurofus osfreafus - hlíva ústřičná (2. 3) rust mycelia na šikmém agaru ve zkumavce 1 týden po pasáži na agar - sladové médium (tma, 25°C) Kultivace drevokazných hub Pleurotus ostreatus - hliva ústřičná rust mycciia na Pctriho misce 2 týdny po pasáži na agar - sladové médium (tma, 25°C) Kultivace drevokazných hub Pleurotus ostreatus - hliva ústřičná rust mycelia na slenených perlách 2 týdny po pasáži na 3% sladové médium (tma, 25°C) Pleurotus ostreatus - hliva ústřičná plodníce kukuřičné šustí a vřetena nasycená sladovým roztokem