Kryoprezervace a uchovaní genetických
zdroju
definice metody
použiti
Uchovaní genetických zdroju
Ztráta genetických zdroju je nenahraditelná.
původní rostlinné druhy - výskyt v přirozených ekosystémech - jejich ohrožení je určeno podle míry ohrožení těchto ekosystému.

•  vyšlechtěné kultivary - udržovací šlechtění je pracné a nákladné
Uchovaní genetických zdroju
Uchování semen = nejběžnější a nejstarší metoda
Vegetativní orgány - hlízy, kořeny, cibule, řízky
Uchovaní genetických zdroju:
A.    semena
Uchování semen klasicky = při normální teplotě
(max. 1 - 5 let) Semenné banky = uchování semen na delší dobu
(při - 20°C)
ortodoxní semena - přežívají sr\\zer\\ obsahu vody na 5-10%
rekalcitrantní semena - dehydratace nesmí klesnout pod limit 12 -30%
skladovat pod Q°C, tropické druhy pod 10°C
(kávovník, kakaovník, kokosová palma, kaučukovník, z našich: dub, buk, jírovec, kastanovník)
Uchovaní genetických zdroju:
'
B.    vegetativní orgány
uchovávam vegetativních organu
(hlízy, kořeny, cibule, řízky - brambory, česnek, réva, bataty, banánovník, )
rizika:
• choroby (houbové, virózy)
škůdci
nepříznivé podmínky (teplota, vlhkost...) pracné a nákladné (prostory, manipulace)
Genové banky in vitro
uchování aktivně rostoucích kultur
uchovaní kultur v minimálním růstu
kryoprezervace
Uchovaní aktivně rostoucích kultur
-  pracné - pasáže: dny, týdny, měsíc
-  nákladné (energie, prostory)
-  nebezpečí infekce
-  nebezpečí somaklonální variability
»ředstavují paralelu ke klasické polní bance
hledaly se podmínky pro prodloužení subkultivačního intervalu
chovaní kultur v minimálním růstu
metody založené na kultivaci při sriižené teplotě rostliny z mírného pásma:    20 - 25°C   4 - 10°C
rostliny z tropu:         25 - 30°C
15 -20°C
metody založené na modifikaci složení kultivačního média - sr\\žer\\ koncentrace solí (MS 1/2 - MS 1/4), přídavek osmotíka - 3% manitol, 5% sacharóza, ABA
metody založené na modifikaci plynného složení atmosféry v kultivačních nádobách
Uchovaní kultur v minimálním růstu
Výhody:
možnost vizuální kontroly
testování na patogeny - možnost mezinárodní výměny
menší nároky na prostor (2m2 x 1 ha)
Problémy:
stres muže mít vliv na regenerační schopnost
muže být ovlivněna genetická stabilita - nutnost kontrol
(kritéria morfologická, cytologická, biochemická molekulárně-biologická=ĎNA)
Solanum, Medicago, Fragaria, Prunus, Malus, Beta
•  uchovaní materiálu při nízkých teplotách, nejčastěji v tekutém dusíku (-196°C) (P. Ďebergh)
•   neletalm skladovaní pletív nebo tkaní při ultra nízkých teplotách (E. E. Benson)
Kryoprezervace semen
Irr/))"
onveíuiořial storage
i f ■■ <
testovaní klíčivosti skladovaných semen
OryOĽcHiu sLuraee kinoc 198.
http: //www. ars -grin. gov/ncgrp/pl_research_projects. htm#SeedStor
Cíl kryoprezervace
uchování rostlinného materiálu po delší dobu za účelem
minimalizace růstu a vývoje in vitro
uchování životaschopnosti a genetické stability
zachování plného vývojového a funkčního potenciálu
setrem pracnosti
tvorba ledu ■ extracelulární - začína dříve
intracelulární (nukleace) - velké ledové krystaly poškozují struktury organel = snaha o zmenšení velikosti krystalu ledu
vlivy poškození různými roztoky
Přístupy ke kryoprezervaci
tradiční = aplikace chemických kryoprotektiv a kontrolované, pomalé zmrazovaní
0,5- 1°C/ min
(vyžaduje speciální přístroje) novější = rychlé zmrazovaní vitrifikace enkapsulace/dehydratace
(relativně dostupnější)
Možnosti kryoprotekce rostlinného materiálu
•   penetrující - ovlivňují biochemické a strukturální vlastnosti membrán, a tak zvyšují toleranci k mrazu (ĎMSO, glycerol, etylenglykol, prolin)
nepenetrujici - mají vliv většinou jako osmoticky dehydratační (sacharóza, manitol, sorbitol, PVP)
Pomalé kontrolované zmrazovaní
aplikace chemických kryoprotektiv
bod
postupné kontrolované ochlazování pod Dod mrazu (-30 až -60°C), pak vložení do tekutého dusíku
- pomalé ochlazování zvyšuje dehydrataci buněk, což snižuje bod mrznutí
po zkoncentrování buněčných roztoku pomalým ochlazováním muže být zbývající voda vitrif ikována rychlým zmrazením
•  zpětné rozmrazování má být co nejrychlejší
kryozkumavka
/i
l_Z]
LN
i -
CZl
^
-ISCPC
-17^
-196nC
Ukládání vzorku do tekutého N
Pristroj KryolO pro klasickou kryoprezervaci
kontrolované pomalé zmrazovaní v kryozkumavkách
Průběh zmrazovaní vzorku kalusu
t/min/
T/°C/
netěsnosti
ventilu
při napouštění
30
£E
50
60
■ j  ■ r - - n  ■ ■  i  ■ ■ ■ w ■  r r r n I  ■
teplota uvnitř ampule
teplota uvnitř chlazeného prostoru
________■■■■>
ampule do N;
Vitrifikace
proces velmi rychlého zmrazení, při kterém je zabráněno tvorbě ledových krystalu, protože vodný roztok je příliš koncentrovaný - zabránění nukleace ledových krystalu
voda tuhne do tzv. sklovitého amorfního tvaru
negativně muže působit na životaschopnost materiálu vysoká koncentrace kryoprotektiv, která je nutná pro navození vitrifikace
= nestabilní stav - muže vést k tvorbě krystalu při zahřívání
Postup: „Enkapsulace / dehydratace"
kultura prýtu
otužení materiálu - zvýšená osmotická hodnota ________média, snížená teplota kultivace______
izolace meristému
enkapsulace: přenos do 3% alginátu
nasátí alginátu s meristemem do špičky pipety
nakapání alginátu do 0,1 M roztoku CaC\2
_________polymerace alginátu 30 min._________
dehydratace: osmotická (0,75M sacharóza) 1-5 dní osušení ve sterilním vzduchu f low-boxu 1-4 hod přenos vysušených kuliček do kryozkumavky rychlé zmražení - vhození do N2
V Alqiri
Alginótové perly s vyrostajícími prýty brambor (Solanum tuberosum) z enkapsulovaných meristémů
Uchovaní genetických zdroju révy
	K*í línii!;
í *   4Ě	
krátkodobé skladovaní dospělých v zimě odebíraných řízku
řízky rašily po 1.5 roce skladování při -3°C hodnocení tolerance kryoexpozíce mer istému vybraných linií z axenických kultur
vývoj metod pro dlouhodobé uchování genetických zdroju révy
http: //www. ars - grin. gov/ncgrp/pl_research_extra_pro jects. htm#grapepre:
Používaní metody kryoprezervace v Kew

Pferis adscensionis
http: //www. kew. org/ksheets/pdf s/K3 l_cryopreservation. pdf
Příklady využiti kryoprezervace
meristému
Německá sbírka mikroorganismu a buněčných kultur (ĎSMZ, Braunschweig, Německo) - meristémy 519 starých kultivaru brambor - metoda mrazení perel
International Potato Centre (CIP, Lima, Peru) - 345 kultivaru brambor - vitrifikace
K.U. Leuven, Belgie - 306 kultivaru banánu (1/4 ze světového počtu kultivaru) - vitrif ikace
kasava, česnek, máta a australské ohrožené druhy
Príklady odkazů
dnes již vyžadují heslo
http: //sc ieng. abertay. ac. uk/plant/genebanking. htm
http: //www. ars -grin. gov/ncgrp/volk_lab. htm
on-line kurz kryoprezervace ttp: //www. ucalgary. ca/~kmuldrew/cryo_course
manual firmy Nalgene
http: //www. nalgene I abwäre. com/techdata /Technical/cryo.pdf
/course outline.html