Transformace rostlin
úvod
metody
Biotechnologie
metody využívající různé organismy ve prospěch člověka a současně
pozměňující jejich vlastnosti tak, aby byly co nejlépe využitelné
výrobní postupy:
q získávání potravy
q chemický průmysl
* výroba enzymů - praní, příprava ovocných šťáv, výroba
škrobu...
q farmaceutický průmysl
q výroba oděvů
q biologické čištění vody, bioremediace - ropné produkty, PAH v
půdě
Biotechnologie - kvašení
konzervace rychle se kazících potravin a krmiv
kvašení:
* kvašení mléka - sýry, kefír, kumys, jogurty
* kvašení cukerných roztoků - víno, pivo (bible,
Egypt)
* kvašené proso - boza (Balkán, Orient)
* kvašená rýže - saké (Japonsko)
* kvašené tropické ovoce - pombe (africký nápoj)
* kvašené zelí
* siláže
Definice podle protokolu o biodiverzitě
 LMO = living modified organism
organismus se změněnou genetickou informací, kterou je
schopen předávat do další generace (polyploidizace,
konjugace, transdukce)
 GMO = genetically modified organism
získaný zavedením cizorodé DNA (metody rekombinantní
DNA)
genové nebo genetické inženýrství
,,Klasické" a ,,moderní" biotechnologie
klasické šlechtění LMO
přirozené mutace a jejich křížení
indukované mutace
ozařování UV
ionizující záření
chemomutageneze
vysoké výtěžky antibiotik, produkce enzymů, sladovnický
ječmen
Nevýhoda - metody jsou ,,slepé" = vyvolává se poškození a následně
se čeká, zda náhodou nevznikne výhodná změna.
Navíc nevíme, kolik genů se změnilo a jak.
Příklady kultivarů produkovaných mutačním šlechtěním
Plodina Kultivar Metoda indukce mutace
rýže Calrose 76 gama záření
pšenice Above azid sodný
Lewis neutrony
oves Alamo-X X-paprsky
grapefruit Rio Red neutrony
Star Ruby neutrony
Cynodon dactylon
troskut prstnatý
Tifeagle gama záření
Tifgreen II gama záření
Tift 94 gama záření
Tifway II gama záření
salát Ice Cube ethyl methan sulfonát
Mini-Green ethyl methan sulfonát
common bean Seafarer X-paprsky
Seaway X-paprsky
šeřík Prairie Petite neutrony
,,Klasické" a ,,moderní" biotechnologie
 moderní biotechnologie - umožňují cílený postup - vnášení
pouze žádaného genu beze změny ostatních genů = GMO
 je možný přesun vlastností mezi organismy, které se jinak
nemohou ani potkat
 mohou ale existovat i nechtěné následky
požadavek regulace a správného zacházení s GMO
Cíle moderních biotechnologií
 zvýšení výnosů plodin, produkce dobytka i ryb
 zvýšení nutriční hodnoty, snížení ztrát produkce
 zlepšení chuti, kvality a trvanlivosti potravin
 omezení používání pesticidů a chemických látek (hnojiva,
postřiky)
 získat organismy přežívající za stresových podmínek
 získat obnovitelné a ekologické zdroje pro výrobu
 produkovat léčiva + vakcíny ekonomicky a bezpečně
 vyvinout nové způsoby čištění vod a půd
 připravit enzymy nových vlastností - snížení energetické
náročnosti výroby a ekologických rizik
Obecné schéma transformace
 příprava rekombinantní DNA (konstrukt)
 vnesení DNA do rostlinné buňky (přímo nebo
pomocí vektorů)
 test exprese vnesených genů
 demonstrace stabilní integrace DNA
do rostlinného genomu
Charakteristika rostlinných genů
gen
kódující sekvence (+ repetitivní DNA)
regulační část
kódující úseky = exony
nekódující úseky = introny
promotor
zaváděcí sekvence
terminační sekvence
Ondřej 1992
Promotor
sekvence DNA - schopnost vázat RNA-polymerázu
= zahajovat přepis genu
TATA
box
počátek transkripce
enhancery /rozpoznávací elementy
sekvence promotoru se netranskribuje, ale
rozhoduje o tom kdy, kde a s jakou intenzitou
se bude gen transkribovat
Ondřej 1992
Zaváděcí sekvence
počáteční úsek mRNA, na níž se uchycují ribozómy a
postupují ,,naprázdno" až k prvnímu iniciačnímu kodonu
rozhoduje o stupni afinity ribozómů, tedy o intenzitě translace
Počátek translace
první triplet ATG, rozhoduje o účinnosti translace
Exony a introny počátek a konec intronu GT-AC
Polyadenylační a terminační signál
AATAAA
Ondřej 1992
Metody transformace (vnášení DNA)
přímé
nepřímé - pomocí vektorů
lipozómy uzavírající DNA
elektroporace
mikroinjekce DNA do jádra
bombardování mikroprojektily
vakuová infiltrace
s použitím nanovláken
plazmidy Agrobacterium
rostlinné viry
modifikovaný bakteriofág 
plazmidy intermediární
binární
Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes
Půdní bakterie: Pseudomonas, Corynebacterium
Agrobacterium, Rhizobium
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium rhizogenes
nádory
kořínky
Ti plasmid
Ri plasmid
T-DNA
T-DNA Ti plasmidu (WT)
1. geny pro biosyntézu auxinů (iaaM, iaaH) a cytokininů (ipt) =
dediferenciace buněk a vznik nádorů (,,crown gall")
2. geny pro syntézu nádorově specifických látek, tzv. opinů
(bazické aminokyseliny - oktopin, nopalin, manopin) = zdroj
dusíku, uhlíku a energie pro bakterie
odzbrojené vektory
Mechanismus přenosu T-DNA
intermediární vektor
Vir AVir A
Vir G*
Vir G
fenolické látky
vir
B
B
B
B B B B
B B B B
B
E
E
E
E
E
E
VirD1
VirD2
VirD2 E
E
E
E
E
E
E
E VirD2
VirD2Vir E
protein Vir B
protein
T-komplex
Ti plasmid E
E
E
E
E
E
E
E VirD2
Jádro
T-DNA
Tinland 1996
Agrobacterium tumefaciens
adheze buněk agrobakteria na povrchu rostlinné buňky
Nestlé Research News
,,Crown gall"
nádor vytvořený po umělé infekci Agrobacterium tumefaciens
na stonku tabáku
Agrobacterium tumefaciens
upravený binární vektor LhGR
vir
LhGR T-DNA
KmR
vir
RifR
KmR
pBin+
GntR
DNA
agrobakteria
část plazmidu kódující
virulenci
upravený plasmid
Šámalová 2005
Agrobacterium rhizogenes
indukce tvorby kořenů na segmentu kořene mrkve
Transformace pomocí lipozómů
1. krok
lipozóm+DNA
protoplast
2. krok
transformovaný protoplast
http://www.aapspharmscitech.org/articles
/pt0702/pt070232/pt070232_figure1.jpg
Nallamothu et al. AAPS PharmSciTech. 2006
Transformace s elektroporací
BioRad Laboratories
1. vyžaduje použití protoplastů, kvasinek, bakterií
2. DNA proniká do buněk přes plasmalemu po vytvoření
dočasných pórů vlivem působení elektrických pulzů
Mikroinjekce
Biolistické metody - výhody
1. mohou být aplikovány na různé cíle, včetně buněčných a
tkáňových kultur rostlin i živočichů
2. využívají pulsy hélia, které urychlují částice zlata nebo
wolframu obalené DNA
* vysoce efektivní i pro nedělící se buňky
* použitelné i pro rostlinné buňky
* stačí malé množství DNA
* lze použít in vitro, in vivo
BioRad Laboratories
Gene gun
Biolistické metody ­ schéma
BBC news
Princip biolistické metody
krystal wolframu
obalený DNA
bombardování pletiva
regenerace
transgenních
prýtů na
selekčním
médiu
Selekční a signální markery
1. rezistence vůči antibiotikům
kanamycin
hygromycin
gentamycin
chloramfenikol
4. GFP (,,green fluorescent protein" upravený gen
z medůzy Aequorea victoria)
a cytostatikům (antimetabolika) methotrexát
3. luc luciferáza (z mořského planktonu Photinus pyralis,
katalyzuje ATP dependentní oxidativní dekarboxylaci substrátu =
luciferin za produkce světelné emise 562 nm)
2. iudA glukuronidáza - GUS
In vitro selekce rezistentních rostlin
Selekce transgenních
rostlin tabáku, které mají
jako selekční marker myší
gen dhfr pro
dihydrofolátreduktázu
rezistentní vůči
methotrexatu (MTX)
M-S médium s přídavkem
MTX
heterozygotní populaceheterozygotní populace
100% sensitivní kontrola100% sensitivní kontrola
Biolistická metoda:
pro transformace pletiv trav ­ GUS marker
exprese aktivity
enzymu glukuronidázy
po bombardování kalusu
Brachypodium
využití kalusové kultury pro transformace
jednoděložné rostliny
jsou resistentní vůči
infekci Agrobacterium
apex karafiátu
substrát =
5-Br-4-Cl-3-indolyl--Dglukuronid
(X-gluc)
Indigogenní metoda detekce glukuronidázy
Arabidopsis
Indigogenní metoda detekce aktivity
glukosidázy
Transformované rostlinky kasavy z
embryogenní kultury
rostlinky vizualizace aktivity luciferázy:
postříkáno luciferinem
a měřeno luminometrem
signální gen = luciferáza
Historie GFP
http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/shimomura.html
fotoreceptory na okraji
klobouku medůzy
Osamu Shimomura (1962)
1955 první popis luminiscence medůzy
2008 Nobelova cena za chemii
Využití GFP
Fusiformní tělíska v síti ER
stonkové buňky Arabidopsis.
Signální peptid GFP-HDEL
GFP v pěstovaných
buňkách tabáku
konfokální mikroskopie
Modifikace GFP
Roger Tsien
La Jola, Kalifornie  
http://www.tsienlab.ucsd.edu/People.htm
Postup experimentu transformace disková
metoda
1. příprava kultury agrobakteria - křížový roztěr na LB
médium s antibiotiky + agar
2. příprava listových segmentů - předkultivace na MSH
s auxinem a cytokininem + agar (2-3 dny v kultivace)
3. Příprava suspenze agrobaktéria pro kokultivaci
(LB médium)
4. kokultivace listových segmentů v suspenzi - 1 min.
5. osušení segmentů a přenos na povrch MSS média svrchní
stranou dolů
6. pravidelná pasáž na médium MSSa (s antibiotikypotlačení
agrobaktéria a selekce), regenerace kalusů
a rostlinek
7. indukce zakořeňování regenerovaných prýtů MSRa
Agrobacterium - média pro kultivaci
LK médium
(Langley et Kado)
sacharóza 10 g
kaseinhydrolyzát 8 g
kvasničný extrakt 4 g
KH2PO4 2 g
MgSO4 0,3 g
destil. H2O do 1000 ml
agar 13 g
LB BROTH High Salt
(DUCHEFA)
25 g do 1000 ml destil. H2O
složení:
trypton 10 g
(kaseinhydrolyzát)
kvasničný extrakt 5 g
NaCl 10 g
agar 15 g
Transformace Arabidopsis
vakuovou infiltrací
Sarah J. Liljegren and
Martin F. Yanofsky*
Dept of Biology, Center for
Molecular Genetics,
University of California at
San Diego, La Jolla,
CA 92093-0116, USA
První povolená transgenní plodina
Calgene a Zeneka
Kalifornie, 1992
komplementární (antisense) konstrukce genu pro
galakturonidázu (pektinázu) - zpomalené dozrávání plodů
rajče Flavr-Savr
první komerčně povolená GMO
odrůda pro lidskou spotřebu
Poprvé prodávána 1994, ale
produkce byla brzy ukončena.
námitky vyvolal selektabilní gen NPTII ­ rezistence ke kanamycinu
Komerční využití GMO
1994 první povolená GM zelenina ­ rajčata Flavr-Savr s
přidaným antisense genem, který interferuje s produkcí
enzymu polygalakturonasy (RNA interference). Tento
enzym je zodpovědný za měknutí buněčné stěny při
dozrávání plodů (= zpomalené dozrávání a dlouhodobá
trvanlivost v obchodě)
1996 první komerční osivo GM kukuřice v USA s rezistencí
vůči zavíječi kukuřičnému
2000 Walmsley a Arntzen - vakcína proti průjmovému
onemocnění (diarrhoea) v GM plodech banánů
2001 Potrykus - GM ,,zlatá rýže" s vyšší schopností
akumulovat -karoten a železo
Transgenní plodiny
 geneticky manipulované hospodářské a průmyslové
plodiny kukuřice, pšenice, řepka, cukrovka,
slunečnice, brambory, soja a bavlna mají zvýšený
výnos a jsou rezistentní proti některým herbicidům
(Round-up) a škůdcům (Bacillus thuringiensis toxin)
 transgenní ,, zlatá rýže " nese gen kukuřice pro
tvorbu -karotenu (provitamin A) a má zvýšený
obsah železa v přijatelné formě
Danaus plexippus, danao stěhovavý
,,Monarch" imago a housenka
http://www.kidzone.ws/animals/monarch_butterfly.htm
Bacillus thuringiensis ­  toxin ­ selektivně působící insekticid
(zavíječ kukuřičný) povolený v USA od r. 1961
Zlatá rýže
zvýšený příjem železa kořeny
konstitutivní ukládání železa do stébel
nese gen kukuřice pro tvorbu
-karotenu (provitamin A) a
gen pro feritin
zrno má vyšší obsah -karotenu a
zvýšený obsah železa v přijatelné
formě
pěstování zlaté rýže má ohromný význam
pro zlepšení výživy, především u obyvatel Asie
Komerčně úspěšné GM plodiny
l zlatá rýže se komerčně pěstuje v jihovýchodní Asii a
významně přispívá k zlepšení zdravotního stavu populace v
rozvojových zemích
l V roce 2001 pěstovaly USA 68% světové výroby GM plodin,
Argentina 22%, Kanada 6% a Čína 3%
l Transgenní plodiny jsou důvodem dlouholetého sporu mezi EU
a USA. Modifikované kukuřici, řepce a soji s rezistencí proti
herbicidu Round-up (glyphosate) spotřebitelé v EU stále
nedůvěřují.
Komerčně úspěšné GM dřeviny
a okrasné rostliny
l Populus nigra tranformovaný genem CryAC (bakteriální toxin
Bacillus thuringiensis) účinný proti housenkám motýlů
(Lepidoptera).
l Čína komerčně vysazuje a pěstuje porosty Populus nigra pro
průmysl papírenský a textilní.
l růže a karafiáty serie Moon, s modifikovanou vůní, firmy
Suntory Ltd. (Japonsko) a Florigene Ltd. (Austrálie) jsou
pěstovány v jižní Americe a prodávány v Evropě, USA, Kanadě,
Japonsku, Austrálii.
l transgenní modrá růže firmy Suntory byla získána přenosem
genů pro tvorbu modrého barviva delfinidinu.
Trendy výzkumu GM okrasných rostlin
a lesních dřevin
okrasné rostliny
l oddálení stárnutí květů: změna biosyntézy etylénu
l změny barvy květu: manipulace s geny pro biosyntézu antokyanů
l změny vůně: manipulace s geny kodující S-linalolsyntázu
l modifikace rezistence vůči patogenům a herbicidům
lesní dřeviny
l modifikace obsahu celulózy, snížení obsahu ligninu a změna jeho
struktury ­ využití v papírenském průmyslu
l rezistence proti fytopatogenním houbám (manipulace s geny
kódujícími peptidy) a škůdcům
l rezistence proti herbicidu Buster ­ méně pracné pěstování