Haploidní techniky androgeneze gynogeneze Význam haploidních rostlin • detekce recesivních alel (v haploidním stavu nejsou překryty dominantní alelou) • zdvojený haploid poskytuje homozygotní línie • materiál muže být použit pro somatickou hybridizaci (fuze protoplastu) - nerii tak indukována Polyploidie Terminologie • haploid = rostlina s gametickým počtem chromozómu monohaploid n = x dihaploid n = 2x (haploid tetraploidních druhu) • zdvojený haploid = doubled haploid plant (D.H. plant) Zdvojení počtu chromosomu působením kolchicinu ____________________2 monoploidní buňky 1 diploidní buňka alternativy kolchicinu = oryzalin, trifluralin, amiprophos-methyl... 1. Androgeneze Tvorba haploidních regenerantu ze samčího gametofytu Vznik haploidu u vyšších rostlin • SPONTÁNNÍ frekvence ÍO3 - ÍO6 - haploidní partenogeneze gynogeneze androgeneze • EXPERIMENTÁLNI = INDUKOVANÁ - klasické způsoby - explantátové metody Vznik haploidu u vyšších rostlin * Klasické způsoby - působení fyzikálních faktoru (UV, X, teplotní šoky) - působení chemických faktoru (kolchicin, maleinhydrazid) - zásahy do procesu opylení a oplození • kastrace (odstranění praš niku) a izolace • opožděné opylování • opylení inaktivovaným pylem • vzdálená hybrídízace - eliminace chromozómu Odvození haploidu u vyšších rostlin Experimentálně = explantatove metody • prašníkové kultury • mikrosporové a pylové kultury • kultivace neoplozených semeníku gynogeneze • chromozomální redukce v kalusových, buněčných nebo protoplastových kulturách androgeneze Haploidní kultury D androgeneze = regenerace haploidních rostlin ze samčího gametofytu -kultury nezralých prašníků nebo izolovaných mikrospor D gynogeneze = regenerace haploidních rostlin ze samicího gametofytu -kultury neoplodnených vajíček Prašníkové kultury tabáku Nicotiana tabacum L. Foto: J. Dubová Historie haploidních kultur 1964 ôuha a Maheshwari - kultivace nezralých prašníků a regenerace homozygotních rostlin durmanu Datura innoxia Mill. 1967 Bourghin a Nitsch - kultivace haploidních buněk (mikrospor) a regenerace homozygotních rostlin tabáku N i cot i ana t abac u m 1976 první zpráva o gynogenezi u řepy Beta vulgaris L 1996 Keller a Korzun - gynogeneze řepy Beta vulgaris Ľ, Allium cepa Ľ, Gerbera jamesonii H. Bolus ex Hook 2000 šlechtitelské programy polních plodin (obiloviny, řepka) využívají haploidní kultury in vitro Faktory ovlivňující pylovou embryogenezi zahrnují vnitřní fyziologický stav výchozí rostliny a její genetické zvláštnosti - druhová specificita • druh rostliny, genotyp • fyziologický stav výchozí rostliny (ontogenetické stáří, fotoperioda, výživa, použití herbicidu) • stadium vývoje pylu * předpusobení na poupata a izolované praš niky (srúžená teplota, centrifugace) * předpusobení izolovaných mikrospor nebo pylu (centrifugace, hladovění, kolchicin) * kultivační podmínky - složení média: • aktivní uhlí • železo Mateřská rostlina optimální fyziologický stav mateřské rostliny je pro prašníkové kultury velmi důležitý ontogenetické stáří - prašníky by se měly odebírat z poupat ze začátku období kvetení výživa, dostupnost vody teplota - u některých druhu se výnos haploidních embryí zvyšuje při predpestovaní mateřských rostlin při nízké teplotě (5°C) fotoperioda - vyšší výnosy haploidních embryí byly získány při pěstování donorových rostlin při krátkém dni a vysoké světelné intenzitě Clarkia xanfania (Onagraceaé) příklad stavby květního poupěte Annals of Botany prašnik Photo: C. J. Runions Scanning electron micrograph of an early floral developmental stage of the outcrossing subspecies of Clarkia xanfania {Onagraceaé). Sepals, which are covered by trichomes, have been partially removed and floral organs have been falsely colored: style and stigma, yellow; large anthers, blue; small anthers, purple; petals, red. Rez praš n i ke m lilie tapetům exothecíum nitka endothecíum mezofyl tetrády mikrospor stomium prašné -^ pouzdro konektiv prašný váček pylová mateřská buňka tetráda mikrospor Meióza I a II tvorba mikrospor: míkrosporogeneze nezralá stěna volné mikrospory Kalózr (^cT}) (^^) CD ontogeneze pylu mikrospora \ migrace jádra vývojová stadia vhodná pro iniciaci aríčfřogeneze nezralé pylové zrno tvorba gamet: dozrávání míkrogametogeneze py|u apertura jádro generat. buňky odvodnění / spermatické buňky pylová mitóza zralé pylové zrno (dvoubuněčný pyl) pylová lačka Tvorba tetrád mikrospor telofáze I. meiotického dělení A distinct layer of cell wall is laid down between the two phases of meiosis in lily. The phases in the second half of meiosis occur rapidly. Telophase II. Cytokinesis between the members of the tetrads is completed. Separation of the cells from the microsporocyte wall occurs soon after. Tetrads completing the callose stage As microspores complete this stage, they elongate somewhat, becoming a bit football shaped Released microspores At this stage, microspores have an exine (outer wall of sporopollenin) but are still filling with storage materials and remain pliable for a short time. Bicellular pollen Generative cells are first formed in contact with the intine (inner pollen wall), but the cells then become immersed in the cytoplasm - truly becoming "a cell within a cell". metafaze I.dělení počátek tvorby tetrád NicoŤiana tabacum L. tetrády mikrospora se zbytky kalózy Vývojová stadia nejdůležitějším faktorem pro získání haploidů je určité vhodné vývojové stadium odběru materiálu do kultury pyl může být frakcionován centrifugací na pe reo I love m gradientu. nutné testování série pupenů, aby byla zřejmá vývojová stadia. Některé snadno rozlišitelné znaky se potom používají pro charakteristiku žádaného vhodného stadia (délka poupěte, poměry délek květních obalů ...) Vývojová stadia poupat tabáku Nicotiana tabacum L. poměr délek květních obalů: stadium 2 = koruna jen o něco málo delší než kališní ušty - vhodné pro prašníkové kultury). Možnosti vývoje mikrospory in vitro diferencovaná jádra mikrospora haploidní proembryo haploidní proembryo podobná jádra fůze jader 2 n diploidní proembryo diploidní embryo Možnosti zvýšení účinnosti androgeneze - predpusobení poupat stres nízkou nebo vysokou teplotou 2-30 dny při teplotách 3-10° C (Nicotiana, Datura, Brassica) nebo 35°C (Capsicum) muže stimulovat embryogenesi máčení oddělených květenství ve vodě po několik dnu = stres hypoxický centrifugace prašníku ^^^ aplikace vakua -------—► změny uspořádání mikrotubulu aplikace kolchicinu ^^ hladovění změrta polohy jádra Možnosti zvýšení účinnosti androgeneze - předpusobení poupat Druh délka teplota Hordeum vulgare 2 dny 3°C Triticum aestivum 2 - 6 dní 4-5°C Zea mays 14 dní 4°C Zea mays 7 + 7 dní 4°C, 8°C Petunia hybrida 2 dny 6°C Brassica napus 14 dní 30°C Typy androgeneze přímá androgeneze = vývoj globulárního embrya a následně haploidní rostliny přímo opakovaným dělením jádra pylového zrna nebo mikrospory nepřímá androgeneze = z pylového zrna nebo mikrospory se vyvine napřed haploidní kalus ->v něm indukce organogeneze ■* regenerace haploidní rostliny přímá androgeneze na prašníku tabáku Nico fiana tabacum L. obnovení diploidního stavu působením kolchicinu > fertilní homozygoti přímá androgeneze klBBT'|BkjiM Anthers cultured nutrient medium embryo i d \ haploid pi anil et / \ haploid ^fe^ Plan1let nepřímá androgeneze 7 dní Androgeneze u tabáku praš nik s embryoídy řez embryoídy http://users.ugent.be/~pdebergh/gam/gam2dp2.htm 14 dní Androgeneze u tabáku praš nik s embryoídy řez embryoídy http://users.ugent.be/~pdebergh/gam/gam2dp2.htm 21 dní Androgeneze u tabáku \: »V * .' A< prašník s embryoídy řez embryoídy http://users.ugent.be/^pdebergh/gam/gam2dp2.htm ■> Androgeneze u tabáku později Prašník tabáku s vyvíjejícími se haploidními rostlinkami, vzniklými z mikrospor http://users.ugent.be/~pdebergh/gam/gam2dp2.htm 55 Prašníkové kultur transgenic tabák - s 2-T3-3 -T4-2 a regeneranti Zmp60.1+MTX® aggie - horticulture. tamu. cdu/f acuity/ king/Tissue_Culture_Lecture. ppt Metoda produkce haploidu u ječmene Hordeum vulgare ječmen obecný 2n = 2X = 14 X Hordeum bulbosum planý ječmen 2n = 2X = 14 izolace embrya haploidní ječmen 2n = X = 7 eliminace chromosomů H bulbosum zdvojení chromosomů mezidruhový hybrid Hordeum vulgare homozygotní ječmen 2n - 2X - 14 ^ dříve mnohem účinnější než mikrosporové kultury (ale má použití jen u ječmene) nyní, při použití zlepšeného média (sacharosa nahrazena maltosou), je mikrosporová kultuře mnohem účinnější (-2000 rostlin ze 100 prašníků) Produkce haploidu a dihaploidu ječmene • mezidruhová hybridizace H. vulgare a H. bulbosum = hybridní zygota • izolace hybridního embrya • eliminace chromozómu H. bulbosum = haploidní rostlinka • zdvojení chromozómu působením kolchícínu = diploidizovaný haploid Výhody mikrosporových kultur oproti kulturám prašníkovým • v prašníkových kulturách často nedochází k indukci dělení mikrospor vlivem inhibičních látek ze stěny prašníku nebo nedostatečným kontaktem s živinami • u prašníkových kultur se muže vyskytnout rychlá proliferace diploidního pletiva stěny prašníku, nežádoucím výsledkem je pak heterozygotní diploid (genotyp mateřské rostliny) • výsledkem míkrosporove kultury je vždy homogenní populace homozygotních rostlin • u mikrosporových kultur je větší nebezpečí infekce Suspenze embryí z míkrospor Brassica napus R. Wellens - in: katalog Duchefa 1996 2. Gynogeneze původ haploidních regenerantu ze samičího gametofytu Gynogeneze • tvorba haploidních rostlin z neoplozené vaječné buňky nebo synergid • embryo tak obsahuje pouze mateřské chromosomy, protože nedošlo k fuzi spermatické buňky s buňkou vaječnou • indukce gynogeneze in vitro = kultivace vajíček nebo semeníku Poznámky na závěr * haploidní rostliny se častej i odvozují cestou androgeneze * žádná z metod pro získání haploidu r\er\\ univerzální pro všechny druhy rostlin * všechny dosud užívané cesty k haploidii je možné využít (indukovat) pouze ve velmi omezeném = krátkém vývojovém stadiu života rostliny. * gynogeneze je zatím omezena jen na několik druhu (Beta, Allium, Oryza, Hordeum, Trftfcum) * rostliny vzniklé cestou gynogeneze jsou lepší kvality než původem z androgeneze - např. u obilovin byl překonán problém albinismu