Jméno:

Datum:


Téma: Přímá somatická embryogeneze z květních lůžek a listů cinerárie (popelivky) (Senecio x
hybridus Hyl.).


Materiál: uzavřená poupata a listové čepele cinerárie


Média:

Murashige nad Skoog (1962) makro a mikroelementy (MS) s přídavkem: 0,55 mM (1 g.l^-1) myoinositol,
2,9 μM (5 mg.l^-1) thiamin-HCl, 13,5 μM (3 mg.l^-1) 2,4-dichlofenoxyoctová kyselina (2,4-D), μM 4,5
(1 mg.l^-1) benzyladenin, 88 mM (30 g.l^-1) sacharosa, 8g.l^-1 agar.

Schenk and Hildebrandt (1972) makro a mikroelementy (SH) se stejnými doplňky jako MS.


Povrchová desinfekce a příprava explantátu.


Postup:

1. Lůžka květenství (úborů)

1.         Úbory s uzavřenými poupaty s 2 cm stonkem se ponoří do 70% etanolu a ožehnou rychlým
protažením plamenem kahanu.

2.         Následuje desinfekce v roztoku 20% SAVO + 0,1% Triton X-100 po dobu 10 min. a trojí
máchání ve sterilní destilované vodě.

3.         Asepticky se odstraní lístky zákrovu a všechny květy a lůžko úboru se rozřízne
vertikálně na poloviny.

4.         (Při silné kontaminaci poupat se doporučuje použít opakovanou desinfekci (květní lůžko
se znovu ponoří do 10% roztoku SAVO na 5 min a 3x máchá ve sterilní destilované vodě).

5.         První explantát se položí na MS medium a označí A, druhý explantát na médium SH a označí
B, pořadovým číslem se pak značí jednotlivé úbory.


2. Listové čepele

Listové čepele prvních pravých listů asepticky vypěstovaných klíčních rostlin a nebo čepele
cinerárie kultivované v in vitro podmínkách se rozříznou na dvě stejné poloviny.

První explantát se položí na MS medium a označí A, druhý explantát na médium SH a označí B,
pořadovým číslem pak jednotlivé listy.


Pokus 1.         Vliv základního média na iniciaci somatických embryí.


medium:          Petriho misky s SH médiem + 13,5 μM 2,4-D + 4,5 μM BA

Petriho misky s MS médiem + 13,5 μM 2,4-D + 4,5 μM BA

Postup:
 1. Povrchově sterilizuj explantáty tak, jak je popsáno výše.
 2. Rozřízni lůžka úborů nebo listové čepele na identické poloviny a polož první polovinu na SH
médium a označ An (n = 1 – x), druhou na MS médium a označ Bn (n = 1 – x).
 3. Kultivuj kultury ve tmě při teplotě 22 - 25°C.
 4. Týdně kontroluj průběh kultivace, vyřazuj kontaminované kultury.
 5. Po 2 a 4 týdnech vyhodnoť četnost somatické embryogeneze a zapiš do protokolu.


Předpokládané výsledky:

Od 2. týdne kultivace se na explantátech kultivovaných na SH médiu vytváří bílý krystalický kalus a
zřídka somatické embryo. Na explantátech kultivovaných na MS médiu se vytváří shluky žlutých
globulárních embryí.

Ve 4. – 5. týdnu kultivace na SH médiu se na listových čepelích rozrůstá bílý kalus, květní lůžka
jsou zduřelá, bez somatických embryí. Explantáty kultivované na MS médiu jsou pokryty
žlutými-žlutozelenými somatickými embryi v globulárním až srdčitém vývojovém stadiu.


Pokus 2.         Dozrávání (maturace) somatických embryí a regenerace rostlin


Iniciace a vývoj somatických embryí jsou často ovlivněny výživou a růstovými regulátory. Složení
indukčních, udržovacích, maturačních a zakořeňovacích médií se často liší. Např. iniciační média
obsahují vysoké koncentrace auxinů a nebo auxinům podobných komponent. Naproti tomu maturační média
neobsahují růstové regulátory nebo jen jejich velmi nízké koncentrace. Zakořeňovací média mají
často redukovanou koncentraci základních solí a cukru.


Materiál:      Petri misky s MS médiem + 0,5% aktivní uhlí

Petri misky s MS médiem bez růstových regulátorů

kultivační nádoby Magenta s MS médiem bez růstových regulátorů

rašelinová multiplata, rašelinový substrát, mikrotenové sáčky


Postup:

1.             Založ experiment, jak je popsáno výše.

2.             Přenes explantáty označené písmenem A na MS medium obsahující aktivní uhlí a označ
jako variantu C, po 3 dnech kultivace je přenes na MS medium bez růstových regulátorů.

3.             Paralelně s bodem 2. přenes další explantáty označené písmenem A na čerstvé MS
médium bez růstových regulátorů a označ jako variantu D.

4.             Kultivuj všechny kultury za stejných podmínek popsaných výše. Rozděl somatická
embrya podle kategorií (globulární, srdčitá, kotyledonární), spočítej a zapiš do protokolu.

5.             Odděl kotyledonární embrya od explantátu a přenes do MS média bez růstových
regulátorů v nádobách Magenta. Kultivuj na světle (25 – 75 μmol.m^-2.s^-1) ve 22°C.

6.             Rostliny 2 cm vysoké přenes do skleníku do vlhkého rašelinového substrátu a překryj
mikrotenovým sáčkem (nebo vlož do mikropařeniště).

7.             Po 2 – 3 týdnech aklimatizace (postupné větrání rostlin) přesaď rostliny do
květináčů a dále pěstuj podle požadavků kultury.


Předpokládané výsledky:

Somatická embrya varianty A se vytváří přímo na explantátu a nerovnoměrně se vyvíjejí – pozorujeme
všechna vývojová stádia. Asi 1/3 kotyledonárnách embryí přenesená na MS médium s aktivním uhlím
vytvoří kořínky a prýty v průběhu 10 dní, ostatní přenášená přímo na M-S bez růstových regulátorů
vytvoří pouze kořínek a nebo neklíčí.

Většina rostlinek cinerárie odvozených ze somatických embryí se lehce aklimatizuje. Květy jsou sice
menší, ale normálně tvarované a vybarvené.


Literatura:

Malueg K.R. et al. (1994): A three media transfer system for direct somatic embryogenesis from
leaves of Senecio x hybridus Hyl. – Plant Cell Tissue, Organ Culture 36: 249 – 253.