ENZYMY METABOLISMU CIZORODÝCH
LÁTEK A CHEMICKÝCH REGULÁTORŮ
SIGNÁLNÍ TRANSDUKCE:
Enzymy 1. fáze biotransformace xenobiotik,
steroidních hormonů a mastných kyselin oxygenázy
(CYP, AKR, FMO, COX, LOX), reduktázy
(AKR, NQO), hydrolázy (esterázy, epoxidhydrolázy).
2. fáze biotransformace (GST, UDPGT, SULF aj.).
3. fáze biotransformace (ABC transportéry)
Enzymy signální transdukce:
Proteinkinázy (,,moduly" mitogen-aktivovaných
proteinkináz ERK, p38, JNK), fosfatázy; další enzymy
biotransformace lipidů (fosfolipázy, další enzymy
biosyntézy/transformace lipidních signálních molekul
­ dihydroceramid-desaturáza, sfingomyelináza aj.).
BIOTRANSFORMACE CIZORODÝCH LÁTEK, STEROIDŮ,
EIKOSANOIDŮ AJ. ENDOGENNÍCH LÁTEK
1. FÁZE BIOTRANSFORMACE:
monooxygenázové reakce
(substrát)
R-H + O2 + NADPH R-OH + NADP+ + H2O
(produkt)
CYP enzymy
- Přenos elektronů z NADPH na CYP enzym
- Aktivace molekuly kyslíku, ,,roztržení" vazby
- Oxidace substrátu (hydroxylace, N-demethylace, epoxidace....)
R-H R-OH
N-CH3 N-H + HCHO
O
- C ­- C - - C ­- C -
CYKLUS CYTOCHROMU P450:
MONOOXYGENACE A AKTIVACE KYSLÍKU
Přenos elektronů:
NADPH
NADPH:P450 oxido-
reduktáza
cytochrom P450
substrát RH,
produkt ROH,
produkce ROS)
Aktivace kyslíku:
ROS = vedlejší
produkty
SPECIFICKÉ SUBSTRÁTY CYP ENZYMŮ
Hydroxylace steroidů
v různých pozicích
(v závorkách isoformy
CYP enzymů)
6-hydroxylace =
specifická reakce CYP3A
HPLC ANALÝZA HYDROXYLOVANÝCH METABOLITŮ 17beta
ESTRADIOLU (lidské CYP enzymy byly exprimovány v hmyzích buňkách
infikovaných baculovirovým expresním systémem)
(hydroxylace E2 lidskými jaterními mikrosomy)
REGIOSELEKTIVNÍ HYDROXYLACE
ESTRADIOLU ISOFORMAMI CYTOCHROMU P450
SPECIFICKÉ SUBSTRÁTY CYP1 ENZYMŮ
EROD / MROD BaP-hydroxyláza Kofeindemethylázy
ROLE CYP1A1/CYP1A2/CYP1B1 A
EPOXIDHYDROLÁZ V METABOLICKÉ AKTIVACI
POLYCYKLICKÝCH AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ
METABOLISMUS POLYCHLOROVANÝCH
BIFENYLŮ (PCB) ­ příklad 1. fáze metabolismu
persistentních organických sloučenin
Mikrobiální
degradace
Metabolismus
u vyšších
živočichů:
oxidativní metab.
(hl. cesta C, D)
Persistetní arom.
sloučeniny: obsah.
Cl v sousedních
pozicích ­ bariéra
vzniku epoxidu
monooxygenáz.
reakcí
NUKLEÁRNÍ A CYTOSOLOVÉ RECEPTORY
KONTROJUJÍCI EXPRESI CYP PROTEINŮ
ENOBIOTIKA, STEROIDY AJ.
ÁTKY INDUKUJÍ VLASTNÍ
METABOLISMUS AKTIVACÍ
RECEPTORŮ (TRANSKRIPČNÍCH
AKTORŮ), KTERÉ KONTROLUJÍ
XPRESI BIOTRANSFORMAČNÍCH
NZYMŮ A ABC TRANSPORTÉRŮ
- vazba xenobiotika na receptor
(aktivace receptoru)
- dimerizace receptoru
- vazba receptoru na specifické
- responsní elementy v promoterových
oblastech cílových genů
NUKLEÁRNÍ A CYTOSOLOVÉ RECEPTORY
nukleární receptory cytosolový receptor
dimerizační partner specif. responsní element v promoterechligand receptoru
NUKLEÁRNÍ A CYTOSOLOVÉ RECEPTORY
KONTROLUJÍCÍ EXPRESI CYP ENZYMŮ
SEZNAM CYTOCHROMŮ P450 (CYP) ZODPOVĚDNÝCH ZA
BIOSYNTÉZU / METABOLISMUS STEROIDŮ A
METABOLISMUS XENOBIOTIK
CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1: genová exprese regulována AhR (indukce
ioxiny, PAH; endogenní ligandy?) monooxygenace PAH, estradiolu;
CYP2B: exprese regulována GR/CAR, indukce steroidy, fenobarbitalem,
monooxygenace velké řady xenobiotik, testosteronu aj.
CYP2A, CYP2C, CYP2D
CYP2E: indukce především stabilizací proteinu (indukují etanol, pyrazol aj.),
monooxygenace etanolu, (-1)-hydroxylace mastných kyselin
CYP3A: exprese regulována GR/PXR; indukce dexametazonem aj. steroidy,
monooxygenace velké řady xenobiotik (nejdůležitější enzym biotranformace),
-hydroxylace testosteronu
CYP4A: exprese regulována PPAR, indukce peroxisomálními proliferátory
clofibrate, dialkylestery kyseliny ftalové), -hydroxylace mastných kyselin
CYP7A, CYP11A, CYP17, CYP19 (aromatáza): enzymy steroidogeneze
další důležité CYP metabolismu vitamínu D3 a kyseliny retinové
REGULACE EXPRESE BIOTRANSFORMAČNÍCH ENZYMŮ:
CYTOSOLOVÝ Ah (aryl hydrocarbon) RECEPTOR
CYTOSOLOVÉ RECEPTORY: AhR
(Aryl hydrocarbon receptor)
CYP1A1/1A2/1B1,
UGT, GST, NQO1 p27, Bax, ... přímé interakce (ER?,..)
AhR kontroluje genovou expresi
biotransformačních enzymů regulátorů bun. cyklu /
apoptózy
?
AKTIVACE Ah RECEPTORU A INDUKCE CYP1A1
SUBSTRÁTEM CYP1A
AhR/ARNT nasedá na XRE = DRE = xenobiotic (dioxin) response element
substrát S je ligandem AhR monooxygenázová reakc
LIGANDY AhR
Strukturní podobnost (šířka, výška, molekulární objem, planarita molekuly)
Nekoplanární látky
(např. PCB se dvěma
chlóry v pozici ortho)
nevykazují planární
pozici aromatických jader
a nejsou agonisty AhR
TCDD = nejsilnější agonista AhR
= modelový dioxinový toxikant
ENDOGENNÍ AGONISTÉ AhR
dosud nejsou známy (deriváty tryptofanu ?)
Funkce AhR:
nezbytný v řadě
proliferačních a
vývojových
procesů
(viz myší AhR-
deficientní
modely)
AKTIVACE Ah RECEPTORU / AhRDEPENDENTNÍ
GENOVÁ EXPRESE
rodukty genové
xprese:
detox./bioaktiv. enzymy
apoptóza;
bun. cyklus;
?
římé interakce AhR
,,cross-talk" s ER, ...)
egulace AhR:
degradace AhR po
avázání ligandu
AHRR = AhR represor
REGULACE CYTOCHROMU P4501B1 (CYP1B1)
DRE =
dioxin
response
element
MĚŘENÍ AKTIVACE Ah RECEPTORU
(transgenní model - luciferázový reportérový gen)
TCDD and Related
Compounds
LightLight Luciferase
Nuclear
Factors
1
P
+ AhR
HSP90
HSP90
Src
HSP90
HSP90
Adapted from Blankenship (1994)
DRE-Luc
AhR
ARNT
Modulation of Gene
Expression
ARNT
Src
"Activated"
2
P
P
Cytosolic
Proteins
Membrane
Proteins
Increased Protein
Phosphorylation
TCDD and Related
Compounds
LightLight Luciferase
Nuclear
Factors
1
P
+ AhR
HSP90
HSP90
SrcSrc
HSP90
HSP90
Adapted from Blankenship (1994)
DRE-Luc
AhR
ARNT
Modulation of Gene
Expression
ARNT
Src
"Activated"
2
P
P
Cytosolic
Proteins
Membrane
Proteins
Increased Protein
Phosphorylation
REGULACE EXPRESE BIOTRANSFORMAČNÍCH ENZYMŮ:
NUKLEÁRNÍ RECEPTORY
NUKLEÁRNÍ RECEPTORY (NR)
NUKLEÁRNÍ RECEPTORY:
struktura domén receptorů
vazba ligandu
aktivace MAPK
NUKLEÁRNÍ RECEPTORY
Ligand-independentní
modulace
ranskripčního
aktoru (MAPK, PKA,..)
NUKLEÁRNÍ RECEPTORY
NUKLEÁRNÍ RECEPTORY
NUKLEÁRNÍ RECEPTORY
NUKLEÁRNÍ RECEPTORY:
vazba antagonistického a agonistického ligandu
Antagonisté:
vazba bez
transaktivace
REGULACE GR / PXR / CAR
aktivace nízkou vs. vysokou koncentrací ligandu
REGULACE GR / PXR / CAR
Více úrovní
regulace
REGULACE GR / PXR / CAR
REGULACE CAR FENOBARBITALEM
Další faktory
modulují
aktivaci
transkripce
FENOBARBITAL (PB) ­ AGONISTA CAR
A DALŠÍCH PROCESŮ
iotransformace:
nzymy 1. fáze
nzymy 2. fáze
PPAR
Peroxisomal
roliferator-
Activated
Receptor alpha)
ontroluje expresi
CYP4A1 a enzymů
metabolismu
pidů
Induktory:
mastné
kyseliny,
hypo-
lipidemika
(fibráty),
environ.
látky
(ftaláty)
LIGANDY PPAR
Di(2-ethylhexyl)ftalát (DEHP)
C O­ ­CH CH2­ ­ ­ ­ ­CH CH CH CH2 2 2 3
C O­ ­CH CH2­ ­ ­ ­ ­CH CH CH CH2 2 2 3
O CH2
CH2
CH3
CH3
O
Farmaka
(hypolimidemika)
Environmentální
kontaminanty
(Endogenní) lipidy
DŮSLEDKY AKTIVACE PPAR
erovnoměrná
ndukce CYP4A
vedl. produkt: H2O2)
dalších enzymů
např. CAT)
ependentních
a PPARalfa
REGULACE DALŠÍCH ENZYMŮ 1.FÁZE
BIOTRASFORMACE
KLASICKÝ POHLED NA INDUKCI GENOVÉ
EXPRESE KONTROLOVANOU XRE A ARE
Miao et al., Biochem. Pharmacol., 2004
RE = antioxidant
esponse element
ifunkční induktory
xenobiotika induk.
hR a Nrf2
ST =
nzym 2. fáze
iotransformace
TRANSKRIPČNÍ FAKTOR Nrf2 JE REGULOVÁN
OXIDATIVNÍM STRESEM / ELEKTROFILNÍMI
METABOLITY A TAKÉ AKTIVACÍ AhR
Miao et al., JBC, 2005
INDUKCE BIOTRANSFORMAČNÍCH
ENZYMŮ A REGULÁTORŮ
ADAPTAČNÍCH ODPOVĚDÍ
MŮŽE BÝT MODULOVÁNA
INTRACELULÁRNÍ SIGNÁLNÍ
TRANSDUKCÍ
(příklad MAPkináz a indukce enzymů
2. fáze biotransformace,
některých enzymů 1. fáze (AKR, NQO)
a antioxidačních enzymů;
ARE/EpRE = antioxidační/elektrofilní
response element, specifická
sekvence DNA v promoterech genů)
ALDOKETOREDUKTALDOKETOREDUKTÁÁZYZY
-většinou monomerické NAD(P)(H)-dependentní oxidoreduktáz
- konvertují karbonyl alkohol
- dosud 115 enzymů ve 14 ,,genových rodinách"
- substrátová specifita: cukerné aldehydy; steroidní hormony;
prostaglandiny a lipidové aldehydy; chemické karcinogeny
(NNK, PAH-trans-dihydrodioly, aflatoxindialdehyd)
Příklady lidských AKR:
AKR1A1 (aldehydreduktáza)
AKR1B1 (aldosareduktáza)
AKR1C1-1C4 (20-, 3-, 3/17-, 3-HSD)
AKR1D1 (5-reduktáza)
1. fáze biotransformace PAH:
účast CYP1A1/1A2/1B1 (monooxygenace), EH
(hydroláza) a AKR (reduktáza)
katecholy =
- metabolity PAH
- podobně
metabolity
steroidů (E2)
Detoxikace
versus
bioaktivace
ALDOKETOREDUKTÁZY
Detoxikace NNK
Biotransformace aldehydů
lipidní peroxidace
REGULACE ALDOKETOREDUKTÁZ
EPOXIDHYDROLÁZY
Funkce:
- metabolismus lipidů (epoxidů) v živočišných a rostlinných buňkách
- metabolismus intermediátů xenobiotik s epoxidovou skupinou
celkem 7 forem EH:
- savčí solubilní (cytosolová) EH
- mikrosomální EH
- leukotrien A4 hydroláza
etc.
Regulace?
ROLE CYP1A1/CYP1A2/CYP1B1 A
EPOXIDHYDROLÁZ V METABOLICKÉ AKTIVACI
POLYCYKLICKÝCH AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ