Deregulace cytokinetiky indukovaná ionizujícím zářením a možnosti jejího ovlivnění modulací metabolismu PUFAs A. Kozubík, J. Hofmanová ^Mvlekinelikv Blofyslkólnf Ostav nvČR. BRNO Cíle prezentace Ukázat příklady výsledků možností ovlivnění radiačního poškození modulací metabolismu fosfolipidů s využitím tkáňových kultur, modelů in vitro a in vivo & laboratoř y tokinetiky fliofyzikální úslov ÍIVČA, HANO BIOLOGICAL MEDIATORS ßiofyzikälm üstav AVCA, ARNO THE ARACHIDONIC ACID CASCADE ^Membrane WMi\y, CeH /^Membrane:;- \ (Phosphoiipase) Release COOH Arachidonic (T) Cyciooxygenase o OH OH Prostaglandins Thromboxane prostacyclin (Aspirin Indometacin) Acid OCZXX^ Lipoxygenase o Lipoxins (A & B) Hydroxy Fatty acids (HETEs. HPETEs) TGlu-Cys-GJy I Leukotriene B4 COOH C5H 11 Leukotriene C4 —► LTD4 —► LTE4 S tresor poškození navozující podnět as Reakce protektivní „režim ovlivnění" - (možnosti modulace) oberciloř ylokineliky Riofyzikální ústav AVČA, HANO Arachidonic acid: metabolic pathways and its possible modulations INDOMETHACIN DICLOPHENAC cyclooxygenases PROSTAGLANDINS THROMBOXANES PROSTACYCLINS abbreviations: ETYA = 5,8,11,14 -eicosatetraynoic acid ESC esculetin NDGA = nordihydroguaiaretic acid FLAP = 5-lipoxygenase activating protein 9-HE 9-hydroxyellipticin HETEs = hydroxyeicosatetraenoic acids HPETEs = hydroperoxyeicosatetraenoic acids EETs = epoxyeicosatrienoic acids SKF525A = = proadifen 12-lipoxygenase SKF525A, 9-HE 5-lipoxygenase p450-MONOOXYGENASES 12 7^ 12-HETEs 12-HPETEs FLAP MK - 886 (^-lipoxygenase; ciborcitor ylokineliky nioryzik^lnr uslov flVCR, ARNO MEMBRANE PHOSPHOLIPIDS FLAP MK-886 (15 - LIPOXYGENASE) ciborolory ylokinetics Hcademv of Sciences Czech Republic Výsledky na krvetvorných buněčných populacích in vivo obo rotor ylokinelik y l»isrVxikalni ústav fiv£nr UNO K vciborcilor y tokinetiky ßiofyzikälni Oslav AVCA, ARNO The early acting growth factor which maximises host defense Proerythroblast I EPO O Megakaryocyte Neutrophilic Myelocyte Igm-csf ic-csf Promonocyte Erythrocyte Platelets Polymorpho- nucleated Neutrophil I; ioc} gm-csf m-csf Eosinophilic Myelocyte igm-csf jlL-5 Basophilic Myelocyte Monocyte 5m-csf -csf Eosinophil IIL-3/IL-4 Basophil IL-3/IL-4 Mast Ceii IS) 35 30- 25- 20 15- 10- 5- j CH ■ o m «- co t-- O Ö Ö -j C NDGA(mg) Fig. 1. Numbers of endogenous macroscopic spleen colonies (ESC) in mice irradiated with a dose of 5 Gy 1 hour after i p. injection o^ariouTdos^ respective groups comprised 20 to 30 animals* * p<0.05, ** p<0.01 as compared with control (C) mice NONJRRADIATED | ^ CONTROL NDGA(mg) Ffe- 2. Dynamics of the postirradiation recovery of GM-CFC in mice irradiated with a dose of 5 Gy 1 hour after i,p. injection of various doses (0.015 to 0.3 mg) of NDGA. * p<0.05, ** p<0.01 as compared with control (C) mice oborotor ytokinetiky Aiofyzikölni üstav AVCA, ARNO Kostni ren Indices Non-irrad. control Exp. group Days after irradiation 5 10 14 21 Granulocytes 595.8+52.9 C NDGA 406.4±51.8 717.7*+64.0 971.5+130.8 1597.8+176.0* 601.1+82.2 575.7+37.5 1300.4+131.2 1486.4+187.9 Lymphocytes 3184.2±239.4 C NDGA 787.5+81.8 935.9+83.5 830.8+140.0 1025.9+113.0 1575.2±141.6 1617.6+105.5 1831.6±244.9 2121.3+268.1 Nucleated cells per femur x 1073.0141+0.1476 C 0.824O±0.0942 1.5486+0.0657 1.8255+0.0778 NDGA 0-7577+0.0417 1.6477+0.440 2.2960+0.1500* 2.4760+0.0721 3.4919±0.2023** Numbers of granulocytes and lymphocytes, and bone marrow cellularity measured at selected postirradiational intervals in control (C) and experi-l mental mice treated with NDGA at a dose of 0.3 mg per mouse 1 hour before 5 Gy gamma-irradiation. At least 10 animals per group were used. *p<0.05; **p<0.01 as compared with control (C) mice Fig. 3. Endogenous spleen colony numbers (ESC) detected on day 10 (A], GM-CFC numbers in femoral marrow on day 2 (B) and exogenous spleen colony numbers (CFU-S) in femoral marrow on days 2 and 6 (C) after 5 Gy of gamma-irradiation and experimental treatment (0.3 mg of NDGA, 0.25 mg INDO or 0.51 mg ESCUL, i.e., isomolar doses administered 1 hour before irradiation). Ten mice per group were used for ESC and CFU-S determination; each value for GM-CFC represents the average of 3 independent experiments. * p<0.05; ** p<0.01 *** p<0.001 as compared with control (C) mice ESC(a) 30 25- 20- 15- 10- 5- o-1 1 il => < o S o \A ° -r u LiJ z ^ GM-CFC (b) PER FEMUR 1Q2 *5i 3.0 2,5 d 20 1-5- 10: 05: o- P<0.0 5 I li ID 3 O W § 5 CFU-S (c) PER FEMUR *10z, 10-2,5^ 2.0--1.5-1.0: P<0.05 1 1 < d £ Q a :r ljj z ±1 < vciborcilor ytokinetiky niofVzik6lni uslov flVCR. BRNO oborcitor ytokinetiky niofyzikolni ustov IIVCA, AftNO 200 -, 15 21 R IRRADIATION elated to 100% of irradiated granulocytes (O) and m selected intervals after 5-Gy hation of micc.^nc hour before irradiation, mice ^ere injected i.p. faith indomcthacin (0-3 mg/mousc, closed symbols) or/esculctin (U-1 5 mg/mousc, open symbols). Control micc"7ve^^njccted with the vehicle. Ten mice from two independent experiments per point were used (mcan + SEM). Statistical significance: x, /><0-05; and xx, p<0 0\ as compared with control. S tresor poškození navozující podnět Reakce protektivní „režim ovlivnění" - (možnosti modulace) oberciloř ylokineliky Riofyzikální ústav AVČA, HANO oborcilor ytokinetiky ftiofyzikolnf ustov AVCA, OftNO U)0 en 300 cn CO i 200^ 100 r400 CD ce _i »= => o ^ '—' CD CD CO ^ r300 ex. r200 ct -100 0 Figure 2. Mean ± SEM numbers of CFU-S and GM-CFC in the femoral bone marrow of the 8-5 Gy-irradiated and bone marrow-transplanted mouse determined on day 6 after transplantation. On days 3, 4 and 5 after trans- pianlalkm_mkc_lmi_injrrtrH_with_inHnmPtharin (INDO, 0-025 mg/mousc and dose) or eseuletin (ESCUL, 0-0125 mg/mouse and dose), in two daily doses (a total of six injections were administered). Control mice {open columns and dotted areas) were treated in the same way with the vehicle. Two independent experiments were performed and the data were pooled. Twelve mice per group were used. Statistical significance: x4 /»<005; and xx, jft<0-01 as compared with controls. není oblivněna radiosenzitivita prekursorových buněk CFU-S(a) GM-CFC(b) < OČ. u_ > > ZD 1 2 3 RADIATION DOSE(Gy) 12 3 4 RADIATION DOSE (Gy) Figure 4. Radiation survival curves of femoral marrow CFU-S (a) or GM-CFC (b) populations. Control mice were injected i.p. with the vehicle (□, dotted lines). Experimental animals were treated with indomethacin (0*3 mg/mouse; •—thick lines) or esculctin (0-15 mg/mouse; O—thin lines) lh before irradiation with the indicated doses. Bone marrow for transplantation (CFU-S) or determination of GM-CFC was taken 1 h after irradiation. Results represent pooled data from two independent experiments (mean±SEM). Eight to twelve mice per point were used. Efekty jsou způsobeny zásahy do biosyntézy eikosanoidů a jejich regulačními efekty na krvetvorbu ciborcileř Vtokinetikv Riofyzikálni ústav HVČR, BRNO Shrnutí výsledků radiobiologicky orientovaných pokusů 1) Prostaglandiny hrají negativní a leukotrieny pozitivní úlohu v regulaci proliferace a diferenciace buněk krvetvorby in vitro i in vivo u myší 2) Důležitá je rovnováha v produkci jednotlivých metabolitů kyseliny arachidonové (AA) 3) Účinky klasických radioprotektivních preparátů lze významně posílit regulač-ními zásahy do metabolismu AA pomocí NSAIDs • ^oborat oř ylokinelik y Biofyzikálni ústav I1VČR, ARNO Biofyzikálni ústav ItVČA, DANO Cíle prezentace Ukázat příklady výsledků dokumentujících chování systému se zapojením negativních zpětných vazeb & vciborcileř y lokinetik y Biofyzikolní úslov ÍIVČA, HANO Příklady výsledků kombinovaného ovlivnění voborcileř l»Í4»Fv»hälní Lrxfcnv nVČflr MNO control indomethacin cystamine Indomethacin + cystamine dose (Gy) Kozubík A., Pospíšil M., Netiková J.: Folia biologica (Prague) 36, 291, 1990 ■ laboratoř ylokinelik v Aiofyzikolní ústav AVCA, AANO O i-1-1-1-1-1-1 0 5 10 15 20 25 30 days ter irradiation 6,5 Gy cfeborcitor ytokinetiky Nefyzikální ústav AVČA, AANO Kozubík A., Pospíšil M., Netiková J.: Folia biologica (Prague) 36,291,1990 Kozubík A., Pospíšil M., Netiková J.: Folia biologica (Prague) 36,291,1990 K voboroloř ylokinelik v Nefyzikální ústav AVČR, flRNO control indomethacin cystamine Indomethan + cystamine i i i i i i 0 5 1 1 2 2 3 0 5 0 5 0 days after irradiation 6.5 Gy Aiofyzikolni ustov AVCA, AANO days after irradiation 6.5 Gy představuje veškerou finální produkci v peněžních jednotkách (celkový objem výrobků a služeb) za určité období (zpravidla 1 rok) národními výrobními faktory dané země , bez ohledu na to, ve kterém státě působí. Je odrazem sumy vnějších a vnitřních faktorů schopných ovlivnit ekonomiku Nevypovídá nic o "kvalitě života", finální produkce - taková produkce, která je vyrobena a prodána, aby byla spotřebována domáctnostmi, státem, použita jako investice nebo vyvezena jako export K voberoloř ylokinelik y Biofyzikálni ústav I1VČR, DANO aborcttoř ytokinetiky Biofyzikálni ústav AVČA, OftNO Vývoj reálných mezd (relace k roku 1989) 120-- 110-- 100 E ^ 80" 70" 60" 3990,-Kč 1989 1990 1991 1992 19931994 1995 1996 1997 I 13528,-Kč Q hrubá □mzda čistá mzda optimum funkce cas Dosažení dynamické rovnováhy v systému po podnětech rozdílné intenzity Claboratoř ylokineliky Biofyzikálni ústav I1VČR, ARNO aborcitoř ytokinetiky Biofyzikálni ústav IIVČA, ORNO 1,1- „celkové náklady" potřebné k navození změny stavu (reakce) 3,3' - „celkové náklady" potřebné k utlumení (reakce) nevyvážená regulace tendence k retenci Na tendence ke ztrátám Na 100 - c o N O O Q. 3 C >> 50 - vyvážená regulace (biol. optimum) Na / K poměr v moči o: Pospíšil 1977? ckborciloř ylokineliky Biofyzikálni ústav BVČft, BflNO 100 cl oborotoř ylokinelikv 80- £ 60- £ AO-O 20- q2 0A 0.6 0.8 10 17 —* Na/K Fig. 10. Mortality of rats to the 30th day after X-irradiation with a dose of 7 Gyf divided into groups according to Na/K ratio in the urine (mean values from 5 daily samples of urine before irradiation). The experiment characterizes the results obtained in the spring and summer period and demonstrates the unfavourable significance of extreme variants of the predictive parameter used (after Pospíšil et al. 1971). Na/K Fig. 11. Mortality in groups of mice of the non-inbred strain "H" up to the 30th day after X-irradiation with a dose of 6 Gy, divided according to class intervals of Na/K ratio in the urine (mean values from 2 daily urine samples on the 4th and 1st days before irradiation). Animals caged in groups of five and 25 individuals were used. The results show the U-type relation between the parameter studied and the expression of individual radiosensitivity, and demonstrate the possibility of influencing ;he individual reactivity of animals by external environmental conditions (after PospSil et al. 1976). © © © CO Zj O CD < 2 co O CO < < 2: CO _I o m < CO _J O CD < »- < O 0_Na__0 Q_Na_0 Q_Na_0 Figure 1. — Schematic illustration of the various types of dependence between the individual state of sodium regulation and the values of cellular and metabolic functions under various experimental conditions. nioFyMkalni usfcciv flVCIl, BI1NO r Presentované výsledky jsou příklady - porušené rovnováhy a směřování k jejímu znovuustanovení s využitím mnohonásobných zpětných vazeb vztahů mezi intenzitou a kvalitou podnětů a odpovědí - reakcí (regulacemi) v čase - platnosti určitých typů odpovědi na více úrovních organizace systémů Claboratoř ytokinetiky Biofyzikálni ústav AVČft, BAŇO platí, že - čím větší destrukce systému, tím delší fáze jeho regenerace ustanovení nové rovnováhy - zachování alespoň relativní stability nemohou zajistit jednostranně akcentované tendence (např. důraz na růst) - nutno respektovat existenci protichůdných tendencí, mít však na zřeteli jejich uměřenost, míru (limity jejich působení) Claboratoř ytokinetiky Biofyzikálni ústav AVČA, AANO Záření jako S tresor poškození navozující podnět cas Reakce protektivní terapeutický „režim ovlivnění" - (možnosti modulace) oborciloř ylokineliky Biofyzikálni ústav AVČA, BANO Rychlá metabolická odpověď na akutní stres ciborcitoř Vlokineltky INO 0 1 11 I I—|-1-......-1 05 15 30 60 150 MINUTES OF IMMOBILIZATION Fig.l. Effect of the first immobilization on hypothalamic catecholamine concentration (CA) and plasma ACTH and corticosterone ( B ) levels. X = OH, R = CH3 adrenalin X = OH, R = H noradrenalin X = H, R = H dopamin CH2—CH2—NH£ j se rot on in (5-hydroxytryptamin) "OOC— CH2— CH2— CH2— NH + 4-aminomasdná kyselina (GABA) CH2—CH2—NHJ NH histamin GLYKOLYZA glukosa 2ADP ^ 2NAD fruktosa-1,6-bisfosfát 2ATP 2 pyruvát 2NADH r anaerobní mléčné kvašení 2NADH 2NAD aerobní oxidace CITRATO VY CYKLUS anaerobní alkoholové kvašení 2NADH 6 Os oxidační fosforylace 2 laktát 2 NAD 6COs -4 6H20 2CO. 2NADH 2NAD 2 ethanol Glykolýza přeměňuje glukosu na pyruvát při současné tvorbě dvou molekul ATP. Za anaerobních podmínek probíhá další degradace pyruvátu jako alkoholové kvašení u kvasinek nebo redukce na mléčnou kyselinu ve svalu. Za anaerobních| podmínek je pyruvát oxidován na vodu a oxid uhličitý přes citrátový cyklus a oxidační fosforylaci obo rotor Koncepce stresu: klasické pojetí (H. Selye) 4 stadia Metabolické důsledky kortikoidů a katecholaminů ^kfl ylokinelik v RioFysíkňlm ústav fiv£nr Bil NO aborcitor Vlokineliky INO Fig. 3. Cortioosterone in plasm of rats during the 42 days repeated 150 min daily iimnobilization stress (j£D). —x—• = Values in rats killed without limcbilieation on the given day. = Controls, nonstressed rats. 3 * s- S s s O 7T o > » O = i v© 7T VO vo . o i E* f S3 i jo o < n< POSTIRRADIATION RECOVERY OF PROLIFERATIVE ACTIVITY OF BONE MARROW CELLS CO PREIRRADIATION FATTY ACID BIOSYNTHESIS RADIORESISTANCE Some signaling molecules that bind to nuclear receptors OH Cortisol estradiol testosterone vitamin D3 V I H I CH2-C—COO- I . NH3+ CH3 CH3 CH3 O thyroxine o- retinoic acid Figure 15-12 part 1 of 2. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. NO proteiny cukry lipidy Obr. 15-3 Složité met a bol i ty, jako jsou sacharidy, lipidy a proteiny, jsou nejprve degradovány na své monomerní jednotky, hlavně glukosu, mastné kyseliny a aminokyseliny, a dále na společný meziprodukt — acetyl-CoA. Acetylová skupina je poté oxidována kyslíkem na oxid uhličitý přes citrátový cyklus za současné redukce NAD+ a F AD. Reoxidace těchto koenzymů přes řetězec přenosu elektronů a oxidační fosforylaci vede ke vzniku vody a ATP. cl o bo r ci tor Vtokinetikv INO isoleucin leucin threonin tryptofan glukosa asparagin as parta t oxalacetat citrát as partát fenylalanin tyrosin CITRATOVY fumarát CYKLUS isocitrát sukcinyl-CoA isoleucin methionin valin co2 2-oxoglutarát \ arginin glutamát glutamin histidin prolin Obr 24-8 Aminokyseliny jsou degradovány na jeden ze sedmi obecných meziproduktu. Glukogenní degradace je vyzna-čena zeleně, ketogenní červeně. glukosa glykogen triacylglyceroly glukosa-ó-fosfatasa hexokinasa Slykogcn synthasa glykogen-fosforyiasa syntéza triacyl-gíycerolů glukosa-6-fosfát hormonálně citlivá triacylglycerolipasa pentosa-fosfátová dráha NAPDH glukoneodenefee ATP- fosfoenol-pyruvát-karboxykinasa glukogenní ^ aminokyseliny mastné kyseliny fosfoenolpyruvát I pyruvátkina: pyruvat pyruvát- karboxylasa íolýza ATP syntéza mastných kyselin NADPH" JaJctát pyruváí- i laktát. UehydrogeiW dehydrogenasa acetyl-CoA ) oxalacetát ^ » ketonové látky t ketogenní aminokyseliny NADH + F AD H 2 I oxidační fosforylace ATP 3 -oxidace XADH + Obr. 25-1 Hlavní dráhy energetického metabolismu. >(/> Q. o (/) o Q. Q) O O STRES i poškození tkání-zánět (primární obranná reakce) INTERFERON INTERLEUKINY PROSTAGLAN DINY ^LEUKOTRIENY „MEDIÁTORY" - BRADYKININ WSEROTONIN HISTAMIN NEUTR.PROTE-ÁZY inhibični' působení GLUKOKORTIKOIDŮ (sekundární obranné reakce) NOVÁ : STARÁ KONCEPCE NESPORNE 1. METABOLICKÉ EFEKTY 2. PROTIZÁNĚTLIVÉ PŮSOBENÍ "B Radiační STRES—►„MEDIATORY" Obnovné buněčné populace krvetvorby \ / GLUKOKORTIKOIDY oborotoř n ven, uiio voberciloř ylekinelik y Biofyzikálni Oslov flVČR, AfftNO K vciborotoŕ ylokinelik y Biofyzikálni ústav AVČR, OftNO ■ laboratoř ylokinelik y Biofyzikálni ústav ItVČA, DANO LU O LU O CL n -6 n -3 n -9 KONCENTRACE MASTNÝCH KYSELIN D.G.Cornwell and N.Morisaki. Free Radicals in Biology. Vol.6. 1984 lokineliky