Molekulární podstata nádorového bujení klíč k porozumění procesů v základech lidské rakoviny. Nádor vzniká ze společné buňky, ve které byl - většinou desítky let před vznikem viditelného nádoru - zahájen program neregulovaného dělení. Maligní transformace buňky probíhá přes akumulaci mutací ve specifických třídách genů. Existují dvě třídy genů, které dohromady tvoří jen malou část celé genetické výbavy ale hrají hlavní úlohu v zahájení procesu tvorby nádoru. Ve své normální konfiguraci řídí životní cyklus buňky, tj. sled dějů, při kterých se buňka zvětšuje a dělí. PROTOONKOGENY jsou normální buněčné geny mající základní význam ve fyziologii buňky. Hrají úlohu především v regulaci životního cyklu buněk: ► Buněčného cyklu ► Buněčné proliferace ► Diferenciace ► Apoptózy V průběhu evoluce dobře konzervovány a jejich přítomnost v normálních buňkách všech vyšších organismů předpokládá, že mají základní význam v buněčné fyziologii. Kódují proteiny, které hrají klíčovou na různých úrovních integrace mitogenních signálů nesených růst. faktory a hormony. Jsou-li modifikovány, ať na strukturální nebo kontrolní úrovni, začnou se chovat jako onkogeny a podporují vývoj nádoru. ONKOGENY mutované nebo aktivované protoonkogeny Proces karcinogeneze zahrnuje změněné exprese nebo funkce protoonkogenů na různých stupních transdukce signálů. NÁDOROVÉ SUPRESOROVE GENY (ANTIONKOGENY) zabraňují abnormální buněčné proliferaci ^1 W V posledních 30 letech byla objevena řada genů odpovědných za vývoj nádorů. Na porozumění maligní transformaci má zásluhu zejména široká škála dřívějších prací s onkogenními virusy. První tzv. ONKOGEN s r c (sarcoma) byl izolován v roce 1970 z viru Rousova sarkomu u kuřat. Virus Rousova sarkomu má dvě rozdílné části: část kódující proteiny odpovědné za replikaci viru a část kódující s r c gen umoňující vznik nádorů in vivo u kuřat. Normální kuřecí genom obsahuje příbuzný gen c-src. Později se ukázalo, že řada retro virů je onkogenních. Bylo též prokázáno, že src není jednoznačně retro virový gen, ale spíše téměř přesná kopie genu nalezeného ve všech kuřecích buňkách. Tento normální gen, tzv. proto-onkogen je v retro viru modifikován (aktivován) tak, že působí po přenesení do buněk nádor. Objev s onkogeny příbuzných sekvencí v eukaryotickém genomu stimuloval úsilí transformovat normální buňky DNA stejným způsobem jaký užívají retrovirusy. Mnoho protoonkogenů kóduje proteiny mající vztah k růstově stimulačním signálům přecházejících z vnějšího prostředí do nitra buňky. Růst buňky je deregulovaný, jestliže mutace v protoonkogenů způsobící trvalou aktivaci růstově stimulační dráhy. Toto souvisí se signály, které si navzájem předávají buňky v tkáních. Jedny buňky uvolňují růstové faktory, proteiny (glyko), které se pohybují mezi buňkami a po vazbě na vhodný receptor na povrchu jiných buněk vyvolávají kaskádu dějů, které přenáší tento signál přes cytoplasmu až do jádra. V jádře pak proteiny nazývané transkripční faktory odpovídají tím, že aktivují řadu genů, které pomáhají buňce procházet buněčným cyklem. Podobně funguje i přenos růstově inhibičního signálu. V normální buňce je rovnováha stimulačních a inhibičních signálů pečlivě regulována, protože to souvisí s regulací buněčného cyklu, který je rozhodující pro buněčnou proliferaci a diferenciaci. V nádorové buňce je v důsledku změn v signálních drahách organizace buněčného cyklu narušena. Buňka je vybavena také zpětnovazebnými mechanismy, které mohou působit proti neobvyklým změnám v procesu bun. dělení. Apoptóza - schopnost buňky spáchat za určitých podmínek „sebevraždu", tj. jestliže její základní komponenty jsou porušeny nebo jestliže je její kontrolní systém deregulován. Tak působí např. poškození chromozomální DNA. V tomto procesu se účastní také specifické geny např. p53 nebo bcl-2. Mutace těchto genů pak způsobují poruchy apoptózy. Bylo zjištěno, že neschopnost apoptózy přispívá ke vzniku nádorů a k jejich rezistenci k terapii. 1 J Druhým obranným mechanismem proti neustálé proliferaci je vestavěný buněčný mechanismus, který sčítá a limituje celkový počet dělení buňky, buňka stárne a hyne. Molekulárním nástrojem tohoto sčítaní jsou segmenty DNA na koncích chromosomů tzv. telomery. Ty se při každém dělení zkracují a když dosáhnou kritické délky dochází k stárnutí a krizi. Jestliže tento sčítací systém funguje v nádorové buňce řádně, její nadměrná proliferace je přerušena předtím, než je nádor příliš velký. Aktivací genu, který kóduje enzym telomerázu, který není v normálních buňkách, ale byl nalezen v nádorových buňkách, však dochází k obnově telomerických segmentů a to umožňuje buňce se nekonečně množit, tj. stát se nesmrtelnou. r Většinou trvá desítky let než se v prekarcinogenní populaci nasbírá dostatek mutací k malignímu růstu. U některých jedinců je však tato doba silně zkrácena. To je vysvětlováno dědičností některých genu způsobujících rakovinu. Jestliže rodičovská zárodečná buňka obsahuje mutaci tak u potomka je tato mutace přítomna ve všech buňkách těla a pravděpodobnost vzniku nádoru je vysoká. r Protoonkogeny lze dělit ^ Podle lokalizace jejich produktu na ty, které kódují 1) sekreční proteiny 2) proteiny buněčného povrchu 3) cytoplasmatické proteiny 4) jaderné proteiny ^ Podle funkce jej ich produktů na 1) růstové faktory (např. sis, hst), 2) receptory pro růst. faktory (např. fms, kit, erb B), 3) cytoplasmatické proteiny - protein kinázy (např. raf) a G-proteiny (např. ras), 4) jaderné proteiny (např. myc, myb, fos, jun) Jaderné protoonkogeny jako jsou c-myc, c-fos, c-jun, c-myb - tzv. geny rané odpovědi (immediate early genes) a jejich produkty jsou proteiny vážící se na DNA a fungující jako tzv. transkripční faktory, které regulují transkripci pozdních genů. Jsou většinou aktivovány overexpresí, která může být indukována různými způsoby: translokací (Burkitt lymphoma), insercí retroviru (spíše v experimentálních systémech), amplifikace genů - to je obecný mechanismus aktivace jader, protoonkogenů a byla pozorována u řady nádorů. J RŮSTOVÉ FAKTORY - EGF, TG Fa, TGFß, IGF G - PROTEIN ras, rev —' TYROSIN KINAZY / src, abl 1 I ► PROTEIN / KINÁZA C / RECEPTORY PRO RŮSTOVÉ FAKTORY - EGF-R V -NEU X - PDGF-R JADERNE PROTOONKOGENY myb myc fos jun ▼ GENY PRO RŮSTOVÉ ^ FAKTORY ^ Přenos signálů a růstová regulace v eukaryotických buňkách. Jsou znázorněny reprezentativní protoonkogeneny v signálních dráhách. 19BBHB9 METABOLICKÁ ODPOVĚĎ Onkogeny a anti-onkogeny: hlavní funkční skupiny onkogenních proteinů a jejich pravděpodobná vnitrobuněčná lokalizace. Anti-onkogeny jsou označeny větším písmem. r Mutace protoonkogenu vedoucí k transformaci můžeme funkčně rozdělit do dvou tříd: získání funkce (gain-of-function), kde aktivita protoonkogenu vzrůstá a má za následek abnormální nebo nadměrmou růstovou stimulaci ztráta funkce (loss-of-function), která vede k inaktivaci represorové složky, která normálně negativně ovlivňuje buněčnou proliferaci (nádorově supresorové geny - p53, RB, geny pro antiproliferační molekuly -TGF (3, TNFa, interferon y) V obou případech je výsledkem nadměrná stimulace růstu. J Geny kritické pro vývoj nádorů spadají do dvou jasně rozlišitelných kategorií: dominantní a recesivní 1(A) overactivity mutation (gain of function) single mutation event creates oncogene normal cell activating mutation enables oncogene to stimulate cell proliferation cells that proliferate abnormally |(B) underactivity mutation (loss of function) second mutation /MX mutation event f event normal cell inactivates \ j inactivates ~" tumor \J second gene -suppressor no effect of copy 9ene mutation in one two inactivating mutations gene copy functionally eliminate the tumor suppressor gene, Stimulating cell proliferation ig Lire 23-24. Molecular Bioiogy of the Cell, 4th Edition, Při buněčné transformaci a karcinogenezi se uplatňují autokrinní mechanismy (vznik autokrinní smyčky) - neplánovaná produkce růstových faktorů buňkami nesoucími odpovídající receptory nebo aberantní exprese receptoru. J Tři způsoby aktivace a změny protoonkogenu v onkogen proto-oncogene DELETION OR POINT MUTATION IN CODING SEQUENCE I IDNA. RIMA I hyperactive protein made in normal amounts GENE AMPLIFICATION normal protein greatly overproduced CHROMOSOME REARRANGEMENT I T or nearby regulatory DNA sequence causes normal protein to be overproduced T DNA RNA fusion to actively transcribed gene greatfy overproduces fusion protein; or fusion protein is hyperactive JFigure 23-27. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Šest způsobů ztráty zbývající dobré kopie ■ nádorově supresorového genu ■ HEALTHY CELL WITH ONLY 1 NORMAL Rb GENE COPY £ 3 normal flto gene ^in paternal chromosome rnutatio Rb loc in maternal chromosome ion at V Á 5CUS —~^LJ POSSIBLE WAYS OF ELIMINATING NORMAL Rb GENE |nondisjunction nondisjunction mitotic (chromosome and recombination loss) duplication □ 0 gene deletion point conversion mutation! Figuře 23-29. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Spektrum účinků p53 v modulaci přežívání a frekvence změn genu p53 u lidských nádorů Fig, 1 The spectrum of survival-modulation effects of p53 p21: promotes growth arrest bct-x: blocks apoptosis gadd-45: DNA repair (?) MDM-2 Survival Lung Colon Esophagus Ovary Pancreas Skin Stomach Head and neck Bladder Sarcoma Prostate Liver Brarn Breast Kfdney Blood Melanoma Cervix Testis CD95 (?) Cyclin G (?) p21: promotes growth arrest bax; promotes apoptosis IGF-BP3: inhibition of IGF signalling bcl-2: blocks apoptosis MOR: increases drug resistance Death 13 tO 20 30 40 Frequency of p53 alterations (%] 50 60 Vztahy mezi genetickými a fenotypovými změnami u nádorů Gentic alterations Phenotypic alterations Oncogene Tumor suppressor gene Proliferation Differentiation Apoptosis Response to genetic damage Invasion Metastasis Onkogeny a nádorově supresorové geny mají funkce v regulaci proliferace, diferenciace, apoptózy a odpovědi na genetické poškození. Jejich úloha v invazi a vzniku metastáz je však nejasná. © I NORMÁLNÍ, KONTROLOVANÝ RŮST Nádorově supy. / L_ geny V J © ABNORMÁLNÍ RŮST, ale stále ještě nějak kontrolovaný GAP JUNCTION Ztráta nádorově supr. genů GAP JUNCTION nebo Aktivace více onkogenů isladorově sujkr. Nefunkční mezibuněčná NEKONTROLOVANÝ RUST komunikace NEKONTROLOVANÝ RUST ++ J Poznatky o molekulárně genetické podstatě nádorového onemocnění lze shrnout takto: ► primární pro vznik nádoru jsou změny vyvolané jak genetickými (mutace v DNA) tak negenetickými příčinami (ovlivnění exprese genů) ► karcinogeneze je několikastupňový proces založený na poruše genetické homeostázy a pouze dílčí změna v kterémkoliv článku ke vzniku nádoru nevede ► ke vzniku nádoru může vést jen kombinace poruchy několika různých mechanismů, přičemž cesty, kterými se tak děje mohou být velmi rozdílné ► byly nalezeny velké individuální a mezidruhové rozdíly i tkáňová a orgánová specifita ve spojitosti se vznikem nádorů ► na vzniku nádoru se mohou významně podílet látky z vnějšího prostředí ZMĚNY METYLACE DNA A ACETYLACE HISTONU NÁDOROVÁ EPIGENETIKA EPIGENETIKA - dědičné změny v genové expresi beze změn v sekvenci DNA Epigenetické změny hrají významnou úlohu v karcinogenezi. Savčí buňky mají schopnost epigeneticky modifikovat svůj genom prostřednictvím ► METYLACE DNA, tj. kovalentního přidávání metylových skupin do 5 pozice na cytosinovém kruhu v CpG dinukleotidu s účastí enzymu metyltranferázy. Přibližně 70% CpG zbytků v savčím genomu je metylováno, ale většina genomu je chudá na CpG (2-5%). Distribuce je nerovnoměrná - nahromaděny buď v rozsáhlých repetitivních sekvencích (satelity, centromerické repetice) nebo v krátkých úsecích bohatých na CG, tzv. „CpG islands" (především v promotorových úsecích genů, blízko místa startu transkripce). Jsou normálně nemetylované a tak je umožněna transkripce genů za přítomnosti příslušného transkripčního faktoru. Metylace cytosinových zbytků je spojena s: navázáním specifických proteinů (methyl-binding domain proteins), aktivací histon deacetyláz (HDAC) a histon metyltransferáz, modifikací histonů, kondenzací chromatinu a transkripční inaktivací příslušného genu. Souhra metylace CpG islands pomocí metylačních a demetylačních enzymů je jednou z částí epigenetické kontroly zárodečné a tkáňově specifické genové exprese. Repetitivní genomické sekvence roztroušené mezi zbytkem genomu jsou naopak silně metylovány a hrají asi roli ve vývoji nekódujících oblastí DNA a v utlumení endoparazitických a retrovirových transposonů. Metylace DNA tedy hraje zásadní úlohu v normálním vývoji, v inaktivaci chromozómu X a supresi tzv. parazitických sekvencí DNA. Umožňuje „zapínat a vypínat" geny na správném místě a ve správné době. Aberantní metylace DNA v promotorové oblasti je však také klíčovým mechanismem inaktivace nádorově supresorových genů. Může způsobit zvýšení mutací a dědičně tlumí geny, jejichž promotory jsou asociovány s CpG „islands" a které kontrolují buněčnou proliferaci. Zatím neznámé mechanizmy zabraňují de novo metylaci těchto promotorů u normálních buněk. Důkazy spojitosti mezi metylaci DNA a genovou expresí s využitím inhibitoru metylace - 5-azacytidinu (5-AZA)- mnoho genů může být reaktivováno. Hypo- nebo hypermetylace DNA (obsah 5-metylcytosinu) patří mezi epigenetické (negenotoxické) mechanismy karcinogeneze. Metylační struktura v nádorových buňkách se liší od normálních buněk. Globální hypometylace genomu je doprovázena místně specifickou hypermetylací. Hypermetylace promotorů pro nádorově supresorové geny v CpG „islands" je doprovázena jejich utlumením a růstovou výhodou pro tyto buňky. Hypometylace DNA je naopak spojena se zvýšenou genovou expresí. Metylace DNA může též usnadňovat mutagenezi (5MeC může spontánně deaminovat na tymin -hypermutabilita). ► ACETYLACE HISTONU Genová exprese je regulována i strukturou chromatinu. Histony jsou považovány za důležité „překladatele" mezi genotypem a fenotypem - mají dynamickou funkci v regulaci struktury chromatinu a genové aktivity. Mohou být modifikovány acetylací, metylací, fosforylací, ubiquitinací. Specifická modifikace konců histonů je přímo spojena s aktivní nebo utlumenou transkripcí - enzymy histontransferázy. Chromatin obsahující hypoacetylované lysiny v histonech má kompaktní strukturu represivní pro transkripci. Inhibitory histonových deacetyláz (HDAC) mohou vytvářet otevřené struktury chromatinu a aktivovat určité geny inhibující nádorový růst využití v terapii (butyrát, trichostatin). Histony se podílejí na tvorbě a udržování „epigenetické paměti". Existuje významný „crosstalk" mezi metylací DNA a acetylací histonů při aktivaci i tlumení (silencing) genové exprese. 5AZA a HDAC inhibitory v kombinaci způsobují reaktivaci nádorově supresorových genů J. Lopez et al. Br J Cancer 2009 J Unmethylated CpG T Methylated CpG r Active histone modifications f R e p re ssive h i stone m odi ficatio ns Active transcription ???? Normally expressed genes Normal cell tswpBNF) Euchromatin [ha^kat, kat5 Repressed transcription TTTT * Viral transposons • Imprinted genes MECPS Heterochromatin Repressed transcription nit Cancer cell * Silencing of tumour suppressor genes Active transcription mi * Expression of transposons and imprinted genes * Expression of oncogenes JdkhMJ swi/snf) Euchromatin (hat Figure I Current understanding of some of the changes to DNA and chromatin that occur in cancer cells. In the normal cellr promoters of actively transenbed genes are unmethylated and found within regions of euchromatin. Expression of o:her genes is repressed by promoter methylation and heterochromatin formation. In cancer, this is deregulated, resulting in the aberrant expression of normally silent genes and repression of tumour suppressor genes. Abbreviations: HATr histone acetytransferase; 5WI/5NF, switch/sucrose nonfermentable nucleosome remodelling complex; MeCP2, methyl CpG-bindmg protein 2; HDAC histone deacetylasc. Unmethylated CpG Island Activators Histone Acetyltransferases, Basal Transcriptional Machinery Protect the Island A f ffiíi 1 2 1 1 RNA Transcription Hypermethylated CpG Island Transcriptional Repressors, Histone Deacerylases, DNA Methyltransferases and Methyl-binding Proteins Shut-Dawn the Island ,—a—, Spreading from Methytation Centers, Seeding of Methylation, Selective Advantage... v urn i Transcription is Abolished Figure 1 The typical CpG island ol a tumor suppressor gene is represented in a normal and a tumor eelL The presence of a dense hypermethylation changes completely its molecular environment, White dots, unmethylated CpGs; Black dots, methylated CpGs Utlumení genové exprese aberantní metylací DNA a modifikací histonů CoR HPAC V MeCP2N CH3 DNA methylation histone deacetylation H-3 Lys-9 methylation CH3 CH3 DNA demethylation historie acetylation H-3 Lys-4 methylation CH3 Ac CH3 Ac Nukleosomy v promotorové oblasti. Proteiny vážící se k 5MeC (MeCP2) se váží k metylovaným CpG místům a způsobují tlumení genové exprese histon deacetylázou (HDAC). Přítomnost tohoto komplexu, deacetylace lysinu v histonech a metylace histon-3 lysin-9 histon metyltransferázou přeměňuje nukleosom v kompaktní konfiguraci, která zabraňuje vazbě transkripčních faktorů. Demetylace a deacetylace způsobuje pak zase uvolnění inhibičního proteinového komplexu a tvorbu otevřené struktury nukleosomu, která umožňuje transkripci. Metody využívané pro analýzu metylace - např. metylačně specifická PCR. Primery rozlišují metylovanou a nemetylovanou DNA v nádorových biopsiích nebo tekutině. Další metodiu je v současnosti imunoprecipitace purifikované metylonvané DNA, umožňující detekovat metylační profil DNA celého genomu - DNA methylom). mi RNAs Důležitou součástí epigenetické regulace jsou tzv. malé regulační RNA - mikroRNA (miRNA). V tzv. RISC komplexu se miRNA vážou na částečně komplementární cílová místa genů a mohou řídit buď translační inhibici nebo degradaci mRNA. Tato represe prostřednictvím miRNA j e další cestou jak může byt modulována genová exprese. miRNAs jsou deregulovány u řady nádorových typů a mohou fungovat jako nádorové supresory. Hypermetylace CpG islands spojených se specifickými miRNAs může být jedním z mechanismů, kterým může být miRNA selektivně downregulována.. V případě, že je miRNA situována v kódující oblasti genu, metylace může zároveň tlumit expresi jak genu kódujícího protein tak příslušné miRNA. A % Percentage of CpG Island Hypermethylation in Human Cancer According to the Tumor Type 30 25 20 15 10 5 0 2 3 4 S 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 I.Lvmpbui 2 .Esophagus 3-Stomacli 4. Colon 5, Pancreas 6. Leukemia 7, Uterus S.Liver 9 Jlead & Neck lO.Gttoma lLKidncy 12, Breast 13. Lung 14*Ovary lS.BIadder B 30 25 20 15 10 5 0 Percentage of CpG Island Hypermethylation in Human Cancers According to the Tumor Suppressor Gene r fl I" _P — I -> tf=l r! r=r .. _ u :_. o pl6IMK* pi5imoit> DAPK hMLHl MGMT AFC 7.GSTP1 3.p73 9. pM*" ID. BRCA1 10 Figure 3 (a and b} are alternative ways to present our CpG island hypermethylation profile of human cancer (Esieller et a!.. 2001a). (a) an average value of the frequency of hypermethylation of 11 tumor suppressor genes (plfi1^*4". p!4AR1", pl5JNK4tl. MGMT. hMLHl, BRCAI, GSTPI, DAPK, CDH I, p73 and APQ is shown according to the most common types of human tumors, (b) the other side of the coin: the frequency of CpG island hypermethylation of ten particular tumor suppressor genes in the tumor types described in ». In the cases of plS1' K'4b and hMLHl an overestimation exists due to the high number of leukemias and micro-satellite unstable tumors included, respectively Lilik' I Hallmarks of cancer and different types of genes silenced by aberrant DNA methylation Hallmark" (acquired capability) Gm silenced by DNA methylation Gene function References Insensitivity to antigrowth signals pl6CDKN2A Cyclin-kinase inhibitor flamu et al (1995) induce differentiation cell cycle arrest RAR/i c;řm., lA'iji Cote etai( 1998) Umhrirht pí /// Pflflll Self-sufficiency in growth signals ú Vlili a It J J RASSFIA Regulation Ras pathway UI1IIJ1 IL LU Li lil j [lUUI 1 Dammann et ai (2000) Evading apoptosis Capase-8 Initiate apoptosis Teitz et ai (2000) TMS1 Proapoptosis StimsonandVertino(2002) DAP-kinase Proapoptosis Kissil ť/ff/, (1997) pl4ARF Proapoptosis Robertson and Jones (1998) Limitless replicative potential Rb Tumor suppressor gene Ohtani-Fujitať/ ař. (1993) Sustained angiogenesis Thrombospondin-I Angiogenesis inhibitor li eř o/- {1999) stimulate angiogenesis VHL Herman eial{ 1994) Increased invasion And metastasis E-cadherin Suppress metastasis GrafTří al (1995) TIMP3 Inhibit metastasis Bachman etal{\W) Genome instability hMLHI DNA mismatch repair Esteller (2000) (enabling characteristic) MGMT Repair alkylated guanine Qianand Brent (1997) BRCA1 Repair DNA damage Bianco et al (2000) DAP-kinase, death-associated protein kinase; MGMT (Vmethylguanine DNA methyltransferase; RAR/J, retinoic acid receptor-/í2; Rb, retinoblastoma; TIMP3, tissue inhibitor of metalioproteinase-3; VHL. von Hippel Lindau tumor suppressor gene, The table is illustrative, but not comprehensive. For a list of many cancer-related genes silenced by aberrant methylation, see Tsou et al, 2002, 'anahan and Weinberg (2000), Aberantní epigenetické a genetické děje mohou vést prostřednictvím nesprávné genové exprese k tvorbě nádorů EPIGENETIC EVENTS Aberrant methyiation and histone tail modification GENETIC EVENTS Pathway disruption p53 Inappropriate gene expression Genome instability Incomplete resetting Rb ; -(^)—-(^)— mml ■ —ig«; - Chronic DNA damage Silenced Chromatin r IMORTALIZACE BUNEK Imortalizace zahrnuje inaktivaci specifických nádorově supresorových genů jako jsou RB a p53, které se účastní regulace přechodu Gl-S fáze buněčného cyklu a indukce apoptózy i dalších genů spojených s buněčným cyklem a apoptózou. Kromě toho existuje v buňkách mechanismus - buněčné hodiny - odpočítávající počet dělení a regulující stárnutí buňky. Normální somatická buňka má omezený počet dělení, tj. limitovanou schopnost proliferovat a nastává ireverzibilní zástava růstu tzv. replikativní stárnutí (senescence). TELOMERY - jsou vysoce konzervované nukleoproteinové komplexy přítomné na koncích chromozómů a obsahují tandemové opakující se sekvence DNA bohaté na guanin (TTAGGG) obalené specifickými na DNA se vázajícími proteiny. Telomery tvoří protektivní čepičku kolem genomové DNA a zabraňují chromozomálním ztrátám a aberantním fúzím během mitotického cyklu. Telomery se zkracují s dalšími buněčnými děleními, což může způsobit genovou nestabilitu a změněnou genovou expresi. Buňky procházejí krizovým stadiem (Hayflickův limit) nebo umírají. Zkracování telomer vybudí proliferativní stárnutí přes aktivaci pRB a p53 kontrolních bodů, což vede u p53-wild typů k zástavě proliferace. Dochází k bariéře v proliferaci charakterizované dysfunkcí telomer, extrémní genomovou nestabilitou a rozsáhlou smrtí buněk mechanismy závislými i nezávislými na p53. Délka telomer koreluje s buněčným stárnutím, ale neexistují žádné důkazy pro jasnou korelaci na organismální úrovni a korelace s délkou života člověka či jiných druhů. Heterogenita průměrné délky telomer odráží genetické rozdíly a komplexní rovnováhu mezi procesy, které vedou k degradaci a těmi, které prodlužují telomery. Např. buňky se sebeobnovnou kapacitou mají delší telomery než diferencované, nebo telomery lab. myší jsou delší než u člověka. Telomery jsou kratší u lidských somatických tkání ze starších lidí než u mladších jedinců nebo u zárodečných buněk. Děti s genetickými nemocemi projevujícími se rychlým stárnutím tzv. progerickým syndromem (Down, Werner, At. telangiectasia) umírají v raném věku s tělem 90ti letých a jejich telomery jsou drasticky zkráceny. Imortalizované buňky vznikající z krizového stadia (inaktivací p53 a pRB, overexpresí cMyc a Ras a v důsledku vážné genové nestability) obnovují funkci telomer aktivací telomerázv, alternativním telomery udržujícím mechanismem (ALT) nebo jiným adaptivním mechanismem. Ve skutečnosti mají nádorové buňky kratší telomery než jejich odpovídající normální buněčné typ Tyto telomery se dále zkracují během progrese nádoru a u myších exp. modelů, jsou zkrácené telomery spojeny se zvýšenou genetickou nestabilitou a zvýšenou nebo redukovanou spontánní malignitou v závislosti na genetickém kontextu. Mnoho faktorů (genetických, nutričních, hormonálních, environmentálních, farmakologických) může modulovat udržování telomer a potenciál buněčného života. TELOMERAZA. Telomery nejsou udržovány normálním replikačním procesem. U kmenových, nádorových a imortalizováných buněk, je zkracování telomer zastaveno aktivací telomerázy -reverzní transkriptázy, která rozšiřuje telomerické TTAGGG opakované sekvence. 3 hlavní složky: s telomerázou spojený protein, TLP1, telomerázovou RNA -hTR a telomerázovou katalytickou jednotku TP2 - lidská telomerázová reverzní transkriptáza. Telomeráza používá svou RNA k navázání na telomery, zatímco katalytická proteinová jednotka syntetizuje DNA přímo na koncích chromozómů reverzní transkripcí templátu RNA. Telomeráza je vysoce exprimována ve většině nádorů a kmenových buněk, středně v hyperplastických a metaplastických buňkách a velmi nízká nebo žádá v normálních dif. tkáních a postupně se snižuje s věkem. Její exprese je spojena s vysokým proliferačním indexem a obnovným tkáňovým potenciálem, agresivitou nádorů, vysokým histopatologickým gradem a s proliferací cévního endotelu. Telomerázová aktivace a overexprese je často nezbytným a raným dějem v mnohastupňové karcinogenezi: vzrůstá rychle při chemické karcinogenezi a po zkrácení telomer. Telomeráza není ani onkogen ani nádorově supresorový gen, ale regulována nahoru nebo dolů mnoha faktory a stává se důležitým predisponujícím dějem u karcinogeneze nebo cílené nádorové terapie. Homeostáza systému telomery - telomeráza je komplexní a je svázána s genetickými a environmentálními faktory. Rada faktorů snižuje ( | diferenciační činidla, epigallocatechin gallate (z čaje), antineoplastické látky -cisplatina, doxorubicin, protein fosfatáza 2, MAPK, tamoxifen, androgeny, volné radikály, inhibitory reverz, tarnskriptázy) a řada zvyšuje (I chemické karcinogény, mutace telomerických sekvencí, gamma záření, PKC, EGF, estrogeny) telomerázovou aktivitu. Vztahy mezi telomerázovou aktivitou a nádorovým onemocněním jsou složité a jen částečně objasněné. Telomeráza může paradoxně buď podporovat nebo inhibovat tvorbu nádorů v závislosti na genetickém kontextu. U nádorových buněk jsou telomery kratší a telomerázová aktivita obvykle následuje po zkracování telomer. Ztráta funkce telomer při raném dělení zahajuje genetickou nestabilitu, zatímco v pozdějším bodě progrese nádoru absence telomerázy inhibuje růst. Tak zatímco inhibice telomerázy u ustanovených nádorů může být cenným terapeutickým přístupem, na věku závislé zkracování telomer může být rizikovým faktorem pro nádory tím, že umožňuje obejít kontrolní bod mortality. Systém telomery-telomeráza představuje komplexní skupinu molekul interagujícíh navzájem a modulujících věk buněk, genetickou stabilitu a nádorovou transformaci. Vnější zásahy mohou modulovat žití zvyšováním nebo snižováním délky života, ale s tímto přístupem jsou spojeny také odpovídající problémy. Udržování telomer by mohlo byt důležité pro prodloužení života, ale vzhledem ke složitosti fyziologických mechanismů na buněčné a zejména organismální úrovni, nelze tento problém zjednodušovat. Z onkologického hlediska, může overexprese telomerázy zvyšovat riziko vzniku nádorů. Ačkoliv normální buňky s delší dobou života a udržovanými telomerami se nejeví jako neoplastické, zpoždění fyziologické smrti může zvyšovat pravděpodobnost kontaktu s karcinogény. Telomeráza sama také zvyšuje onkogenní potenciál predisponovaných buněk a je cílem protinádorových terapií. Zatím se pozornost soustřeďuje na zvýšení doby života několika cílových buněk nebo snížení proliferujícíh nádorových buněk. Málo pozornosti je věnováno organismální úrovni, mikro- a makroprostředí, ve kterém tyto buňky rostou jako normální nebo imortalizované nádorové buňky: tj. angiogenezi, růstovým a difernciačním faktorům, cytokinům, hormonům, imunitnímu systému a environmentálním faktorům. ????? Zbývá odpovědět na otázky: Je bezpečné prodlužovat lidský život použitím terapeutických látek? Je lepší prodlužovat lidský život nebo zlepšovat kvalitu života? 1 Rozšiřování na guanin (G) bohatých telomerových vláken telomerázou GGGTTAG J-J-J- GGQTTAGGGTTAG GGGTTAGGGTTAG Holoenzym telomeráza obsahuje proteinové subjednotky včetně katalytické subjednotky s aktivitou reverzní transkriptázy a molekulu RNA, která slouží jako templát pro přidání opakujících se motivů TTAGGG r Stadium terminálni proliferační zástavy (TPA) Normální buňky absolvují určitý počet dělení než navždy opustí buněčný cyklus a zůstanou ve viabilním neproliferujícím stavu - senescence. Při inaktivaci p53 se tyto buňky ještě nějakou dobu dělí a pak zastavují buněčný cyklus (p53-minus TPA). Při narušení jak p53 tak pRb/p16 (např. přítomností virových onkoproteinů), buňka obejde stav senescence a následně je zastavena ve stavu krize. Výjimečně (1 buňka z 107) může překonat krizi a stát se nesmrtelnou. Transdukce několika normálních buněk s expresním konstruktem hTERT může vyústit v expresi telomerázy a obejít stav senescence. Zkracování telomer může vést k chromosomální nestabilitě a vzniku nádoru SELF-RENEWAL OF EPITHELIAL CELL POPULATION BY REPEATED CELL DIVISION -telomeres shorten and uncap *- normal p53 and ceil cycle checkpoint control * normal senescent cells stop dividing loss of p53 and cell cycle checkpoint control I mutant cell survives and proliferates| ♦ chromosome fusion CHROMOSOME BREAKAGE-FUSION-BRIDGE CYCLE cell dies due to catastrophic genomic *" instability and DNA damage chromosome translocation \ / chromosome breakage chromosome bridge massive chromosomal damage telomerase reactivated chromosomes are partially stabilized and cell survives with many mutations + CANCER Figure 23-36. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Imortalizace je nutná,ale ne dostačující pro maligní transformaci ras Normal cells SVdQ-transduoed mortal celte |SV40-irnmortalized cells ras -w- - No transformation! No Maliynant iranslomialionl B Ncrmal cells immortalized cells ras MEK ras ► MEK Premaiure senescence Malignant. iransfomiationl A) In a number of in vitro models it has been shown that oncogenes, such as activated ras, can cause malignant transformation of immortalized cells but not their normal mortal counterparts. In the example illustrated, activated ras caused malignant transformation of SV40-immortalized fibroblasts, but not normal fibroblasts nor SV40-transduced fibroblasts that had not become immortalized (67). (B) Mouse fibroblasts transduced with activated ras obtain a constitutively active MEK signaling pathway. In immortalized cells this may result in malignant transformation, but in normal cells this results in upregulation of p53 and p16INK4a and premature senescence (74). Adenovirová terapie využívající promotoru pro telomerázu viral agent hTERT adenovirus Inhibitory telomerázy a konvenční terapie telomerase inhibitor alone * tumor size telomere WMMUMl! fff—ll length (kbp) 7 6 conventional therapies alone m tumor size ^-O telomere ■MM. length (kbp) 7 conventional therapies + telomerase inhibitor tumor size telomere l—IL'l l—\\ length (kbp) 7 5 HiiHWBIIllJ •MB i n 4 I1UU«WLU; i 7 apoptocio time of treatment