INVAZIVITA - VZNIK METASTÁZ Metastázy - tvorba progresivně rostoucích sekundárních nádorových fokusů v místech nespojených s primárním nádorem. Série definovaných kroků - metastatická kaskáda: ► uvolnění buňky (od okolních buněk, ECM) ► překonání bazálni membrány v epitelech (metalloproteinázy) ► překonání bazálni membrány a endotelu cév ► přenos krevním (lymfatickým) řečištěm ► překonání endotelu, bazálnich membrán v jiné lokalitě ► uchycení v nové tkáni (hyaluronan a jeho receptory - CD44, integriny) ► přežívání, proliferace ► vznik mikro- a makrometastáz - letalita onemocnění Existuje řada genů a proteinů, které regulují metastatickou schopnost buněk a které musí být koordinovaně exprimovány. Ztráta funkce tzv. supresorových genů pro metastázy, které zabraňují tvorbě spontánních, makroskopických metastáz, aniž by ovlivňovaly růst primárního nádoru (prvním z objevených genů je nm23). Význam dostupnosti cév, angiogeneze - tvorba cév v nádoru Struktura metastáz MELANOMA OFTEN SPREADS TO LUNGS PATTERNS OF METASTASIS can explained in part by the architecture of the circulatory system. Tumors in the skin and many other tissues often colonize the lungs first because the lungs contain the first capillary bed "downstream" of most organs. In contrast, because the intestines send their blood to the liver first, the liver is often the primary site of metastasis for colorectal cancers. Yet circulation is not the only factor: prostate cancer, for example, usually metastasizes to the bones. This tendency may result from an affinity between receptors on prostate tumor cells and molecules in bone tissues (inset), j COLORECTAL CANCER OFTEN SPREADS TO LIVER PROSTATE CANCER OFTEN SPREADS TO BONES PROSTATE CANCER CELL RECEPTOR ADHESION MOLECULE v ^ STROMAL CELL j? OF BONE J* Benigní versus maligní nádory \ neoplastic gland tubules normal gland Itubules {cross-section) fibrous connective-tissue capsule of benign tumor normal gland tubules invasive, cancerous gland tubules ADENOMA (BENIGN) ADENOCARCINOMA (MALIGNANT} pigure 23-3. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Proces vzniku metastáz cells grow as a benign tumor in epithelium break through basal lamina invade capillary connective tissue basal lamina travel through bloodstream| (less than 1 in 1000 cells will survive to form metastases) |adhere to blood vessel escape from blood vessel wall in liver (extravasation) proliferate to form metastasis in liver |Ftgure 23-15. Molecular Biology of the Cell, 4-th Edition. Metody výzkumu Metodickým základem současného výzkumu je úspěšné klonování předpokládaných metastatických genů a manipulace s jejich expresí nebo funkcí genových produktů. 3 nejobecněji používané testy metastatického procesu. 1) test na spontánní metastázy - nádorové buňky jsou subkutánně injikovány do syngenních nebo imunodeficientních zvířat. Test napodobuje přirozenou situaci. 2) test na experimentální metastázy - nádorové buňky jsou injikovány intravenózne. Test odhaduje schopnost buněk opustit krevní řečiště a kolonizovat specifické tkáně. 3) test invazivitv - nádorové buňky jsou umístěny na povrch matrix (tvořené např z kuřecí srdeční nebo chorioalantoidní membrány či umělé membrány) a sleduje se migrace tímto materiálem. Poznatky o povrchových a intracelulárních regulačních molekulách účastnících se metastatického procesu jsou vodítkem pro nové terapeutické přístupy - využití specifických monoklonálních protilátek nebo „antisense" techniky. j Význam buněčné adheze Pro vznik metastáz jsou důležité zejména změny v buněčné adhezi a komunikaci Buňky se pro předání signálu musí dotýkat - "juxtacrine signaling" Kontakt buňka-buňka - kadheriny (E-kadherin) na povrchu jsou propojeny přes katenin, vinkulin, plakoglobin s cytoskeletonem - geny kódující tyto proteiny označeny jako supresorové geny pro metastázy Kontakt buňka - extracelulární matrix (ECM) - integriny Anchorage dependence - závislost na podkladu Area code - specifická oblast bazálni membrány „Junctional" a „nonjunctional" adhezivní mechanizmy živočišných buněk pro vzájemnou vazbu a pro vazbu k extracelulární matrix íwinnn LU U ! CO LU X QĽ Z H O MA ESI ELL- ADH O intermediate filaments hemidesmosome focal adhesion (integrins) (integrins) [wr_W mi^TO m JUNCTIONAL ADHESION NONJUNCTIONAL ADH MECHANISMS MECHANISMS integral membrane proteoglycan integrins r Síť proteinových spojů u normálních epiteliálních buněk Malignita - buňky pronikají přes bazálni laminu r Velké glykosylované proteiny syntetizované buňkami gastrointestinálního, dýchacího a močopohlavního ústrojí. Chrání epitel proti mechanickému, chemickému, enzymatickému a mikrobiálnímu poškození. Kódovány řadou genů, tkáňově specifické Hlavní mucin sekretovaný gobletovými buňkami ve střevě -MUC2. Poruchy povrchových mucinů jsou obecnou charakteristikou maligní transformace. Jsou odpovědné za abnormální chování buněk: změny adheze nebo metastázování a uniknutí z imunologického dozoru. j Extracellular matrix Mucin-expressing tumour celf Endothelial cells Red blood ce Figure 4 | Tumours use mucins for invasion, metastasis and protection- a | Tumours use the anti-adhesive effect of mucins to detach from the tumour mass and surrounding stroma and invade (see FIG. 5). b | Tumours use the adhesive effect of mucins to attach to endothelia and invade (see FIG. 6). c | Tumours also use mucins to escape immune surveillance (see FIG. 7). Apical expression of mucins Receptor/ligand for cell-celt adhesion v. AAA Cis interactions Tumorigenesis ä, ■Receptor for cell-ECM adhesion Steric hindrance E n Figure 51 Anti-adhesion by membrane-associated mucins in cancer. Normal epithelial cells express membrane-ass mucins on the apical surface, thereby allowing cell-cell and cell-substratum adhesion. Tumour cells aberrantly express rr associated mucins that are not apically restricted, which block cell-cell and cell-substratum adhesion in two ways. Qs int between membrane-associated mucins and receptors on the same cell could prevent the receptors from interacting with to mediate adhesion. Through steric hindrance, membrane-associated mucins can non-specificallv block adhesion via tht „Docking" Transition „Locking" * slabé a přechodné vazby * zprostředkované zejména rozpoznáním uhlovodík -uhlovodík * Aktivace nádorovách a hostitelských buněk (platelety, leukocyty, endoteliální buňky atd.) tvorba zánětlivých cytokinů, chemokinů a bioaktivních lipidů * Exprese inducibilních adhezívních molekul (selektiny, ICAM, VCAM) EC pevnější adheze nádorových buněk k endoteliálním b. zprostředkované v základu integrinovými receptory Integriny jsou hlavními přenašeči signálu pro následné molekulárni děje (uvolnění od endoteliálních b., interakce s E C M, proteolýza, pohyb buněk a invaze) Hypotéza „docking a locking". Interakce nádorových buněk s cévními endoteliálními buňkami může být rozdělena do počáteční fáze slabé adheze („docking") a pozdější fáze pevné adheze („locking"). Je znázorněna účast specifických skupin adhezívních molekul v těchto dvou fázích. Přechod je zprostředkován širokou škálou bioaktivmích mediátorů jako jsou 12(S)-HETE. TC = Tumor cell; EC = endothelial cells; ECM = extracellular matrix. j Tumor continues to expand, After treatment with antiangiogenic eventually spreading to other organs drugs, tumor diminishes in size ANGIOGENESIS, or neovascularization, involves the proliferation of new blood vessels* The process transforms a small, usually harmless cluster of abnormal cells (known as an in situ tumor) into a large mass that can spread to other organs. Drugs that aim to interfere with angio-genesis—for example, by halting the action of angiogenic proteins—can reduce the size of tumors and potentially maintain them in a dormant state. i ANGIOGENEZE Angiogeneze je proces tvorby nových krevních kapilár. U dospělého jedince je proliferace endoteliálních buněk velmi nízká. Fyziologickou výjimku, kde je ale angiogeneze přísně regulována, tvoří ženský reproduktivní systém a hojení ran. Neregulovaná angiogeneze je spojena s řadou patologických stavů jako je revmatická artritída, psoriasis, diabetická retinopatie a nádorová onemocnění. Nádorový růst a tvorba metastáz jsou závislé právě na angiogenezi, Úloha: ► zásobování živinami a kyslíkem. ► cesta, kudy se nádorové buňky dostávají do oběhu a mohou tak metastázovat v různých vzdálených orgánech. Angiogeneze je komplexní proces zahrnující širokou souhru mezi buňkami, rozpustnými faktory a složkami extracelulární (mimobuněčné) matrix (ECM). Poruchy proteolytické - antiproteolytické rovnováhy Kooperativní aktivita systému proteolytických enzymů: ► Lyzozomální proteázy (aspartyl a cystein proteázy - katepsiny) ► Serinové proteázy - plasminogen, plasminogenové aktivátory (PA) ► Metalloproteinázy Plasminogenové aktivátory - přeměňují plasminogen na plasmin. Plasmin degraduje různé složky ECM včetně fibrinu, fibronektinu, lamininu atd. Plasmin také aktivuje několik typů metaloproteináz. Rodina metaloproteináz (MMP) - asi 16 členů, většina jsou rozpustné sekretované enzymy nebo transmembránové proteiny schopné digesce ECM nebo komponent bazálni membrány. Různé typy podle struktury a substrátové specifity (kolagenázy, gelatinázy, stromelysiny). PAa MMPs jsou sekretovány spolu se svými inhibitory (za normálních podmínek nízká hladina), což zajišťuje přísnou kontrolu lokální proteolytické aktivity a je tak zachována normální struktura tkání. Aktivita PAi MMPje kontrolována na několika úrovních: ► exprese se zvyšuje působením angiogenních růstových faktorů a cytokinů ► pro-MMP a pro-PA mohou být proteolyticky aktivovány ► MMP, plasmin a PAjsou regulovány tkáňovými inhibitory MMP (TIMP). Během nádorového růstu a tvorby metastáz je kontrola proteolytické aktivity narušena. U mnoha typů nádorů (kolorekta, prsu, žaludku, moč. měchýře, prostaty) byla detekována vysoká aktivita MMPs. Byla také nalezena dobrá korelace mezi množstvím MMPs a a agresivitou a invazivitou nádoru. Po proteolytické degradaci zahajují "vedoucí" endoteliální buňky migraci přes degradovanou matrix. Jsou následovány proliferujícími endoteliálními buňkami, které jsou stimulovány řadou faktorů, z nichž některé jsou uvolňovány z degradované ECM. Regulace proteolyzy ECM p/a-cathepsi p/a-cathepsin L /?rt>cathepsiri D pH<5 \+-1 Cystatins stefins ..............Cathepsin D / n b[ CathepsrttB JElasti Cathejpsi cathepsin. L _I Elastic A Latent [antiproteasene^phjjV clasiasc £/u-MMPs PAI-1,2,3 PNI tPA 'Plasmin \ a2-antiplasmin a2-macroglobulio + 1 ril I ll-kld + ld I IIH-lld lid II II ItHtlH III lltllMI IIHII TIMP-1,2,3 a -macroglobulio IIAIItni-liahlfchl-kll hll I hl-khl + hlri h?- Fibronectin laminin protEoglicans Activation llhltllhllIllthlthllIl1tl1hll^ ECM proteins h Inhibition —> Degradation Table 1 Proteases participating in degradation of ECM components Prot eas e fami ly Pro teas e Prote ase f i met ion Pro te ase i nhi b ito rs Aspartyl protease Cysteine proteases Serine proteases CathepsinD CathepsinsB,L, H K Pias min Neutrophil serine proteases Matrix metalloproteinases Urokinase-type plasminogen activator (uPA) Tissue-type plasminogen activator (tPA) Elastase Cathepsin G Collagenases [MMP-1,8,13] Stromelysins [MMP-3, 10] Gelatinases [MMP-2,9] Membrane-type [MMP-14, 15,16, 17,24, 25] Others [MMP-7, 11, 12, 19, 20, 23] Degradation of ECM components Conversion of cysteine procathepsins into cathepsins Degradation of ECM components Conversion of pro-MMPs into MMPs Degradation of ECM components Activation of uPA Conversion of inactive elastase into elastase Conversion of plasminogen into plasmin Conversion of plasminogen into plasmin Degradation of ECM components Degradation of col lagen s and other ECM proteins Activation another pro-MMPs into MMPs Degradation of collagens: I, II, III, VII, X and gelatins Degradation of proteoglycans, laminia gelatins, collagens III, IV, V, IX, fibronectin, entactin, SPARC, collagenases-1 Degradation of gelatins, collagens: I, IV, V, VII, X, fibronectin, elastin, procollagenase-3 Degradation of collagen I, II, III, gelatins, aggrecan. fibronectin, 1 aminin, vitronectin, MMP-2,13, tenascin, nidogen Degradation of proteoglycans, lam in in, fibronectin, gelatins, collagens IV, elastin, ent actin, tenascin, et] -antiproteinase, amelogenin Cystatins, stefins, kininogen ctrantiplasmin, c^-macroglobulin PAI-1,2,3 o^-antiplasmin Oa-macroglobulin s ecret ory leu koprote ase inhibito r TIMP-1,2,3,4 «z-macroglobulin Úloha ROS v proteolytické - antiproteolytické rovnováze Oxidatívni změny biologicky aktivních proteinů závislé na typu a koncentraci ROS ROS 102 02 HO H202 HOCI PROTEIN Incereased proteolytic susceptibility Altered antigenicity Activated neutrophils ROS "e.g. HzOzHCIO] Active Protease inhibitors ■r Inactive Protease inhibitors Pro-proteases Plasmin Metalloproteinases Enhanced proteolysis Modifikace struktury proteolytických enzymů a jejich inhibitorů vede k porušení rovnováhy. Tyto změny zpětně podporují další produkci ROS granulocyty a makrofágy. Zvýšená proteolýza a destrukce ECM - invaze - metastázy Hlavní endogenní i nd u ktorý angiogeneze Peptidové růstové faktory a prozánětlivé mediatory ► vascular endothelial growth factor family (VEGF) a angiopoetiny působí specificky na endot. buňky Působí přes tyrosin kinázové receptory a fungují protiapopticky ► cytokiny a chemokiny přímo působící - aktivují řadu dalších bun. typů. Prototypem je bFGF (basic fibroblast growth factor) a PDGF (platelet growth factor), IL-8, IL-3 ► nepřímo působící faktory (TNF alpha a TGF beta), které působí uvolňování dalších faktorů z makrofágů, endoteliálních nebo nádorových buněk. Např. TNF alpha stimuluje uvolňování VEGF, IL-8 a FGF-2 z endotel. buněk. ► Enzymy_(COX-2, angiogenin), hormony (estrogeny), oligosacharidy (hyaluronan), hemopoetické faktory (EPO, G-CSF, GM-CSF), adhezívní molekuly (VCAM-1, E-selektin), oxid dusíku atd. Geny MMP transkripčně regulovány AP-1 - indukovány cytokiny (IL-4, -10, TGF, bFGF - aktivace MAPKs. Endogenní inhibitory angiogeneze: trombospodin-1, interferon a/p, prolactin, angiostatin, endostatin, vasostatin atd. Zahájení nádorové angiogeneze je výsledkem posunu v rovnováze stimulátoru a inhibitorů. Thromboapondin Endostatin Tumstatin The development of tumour vasculature — angiogenesis — is important for progression of many tumour types, although tumours frequently form abnormal leaky vessels. Angiogenesis is induced by factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor (bFGF) and platelet-derived growth factor (PDGF). VEGF receptors (VEGFRs) are expressed on the endothelial cells of the tumour vessels, whereas PDGF receptors (PDGFRs) are expressed by the pericytes that support bloodvessel growth. VEGF is produced by both pericytes and endothelial cells, and PDGF is produced by endothelial cells, so each cell type produces the growth factor that promotes proliferation and survival of the other cell type. A number of mAbs and receptor tyrosine kinase (RTK) inhibitors have been developed to block these signalling pathways, and have been shown to slow tumour growth in preclinical and clinical studies. Endothelial cells also produce endogenous inhibitors of angiogenesis, such as thrombospondin, endostatin and tumstatin. These are also being developed as anticancer agents. r Úloha buněčné adheze Proces buněčné invaze, migrace a proliferace je zprostředkován také adhezívními molekulami Interakce buňka-buňka a buňka-ECM CAM jsou děleny do 4 základních skupin v závislosti na jejich biochemických a strukturálních vlastnostech: selektiny, imunoglobulinová supergenová rodina, kadheriny a integriny. Členové každé z nich se uplatňují v angiogenezi. K zahájení angiogenního procesu se musí endotel. buňky uvolnit od sousedních buněk. j Během invaze a migrace je interakce endotel. buněk s ECM zprosředkována inteqrinv. Také konečná fáze angiogenního procesu, včetně konstrukce kapilárních smyček a určení polarity endoteliálních buněk vyžaduje buněčné kontakty a kontakty s ECM. Integriny (2 nekovalentně spojené jednotka alfa a beta) - heterodimerizují ve více než 20 kombinacích. Endotel. buňky tak exprimují několik různých integrinů - napojení na široké spektrum proteinů ECM. V aktivovaném endotelu mohou suprimovat aktivitu p-53 a p21 a zvyšovat poměr Bcl2:Bax, což má antiapoptické účinky Další molekuly: ► vaskulární endoteliální kadherin zprostředkovává na Ca2+ závislé homofilní interakce mezi endotel. buňkami. ► členové ICAM zprostředkovávají heterofilní adheze. Jsou zvyšovány TNFalfa, IL-1 nebo INF-gamma. ► P- nebo E-selektin - podporují adhezi leukocytu k cytokiny aktivovanému endoteliu Neoplastická buňka / í COX-2 PG's ■ \ - bFGF ■ ► ?C VEGF Endoteliální buňka PG's Fibroblast t COX-2 PG's VEGF Permeabilita, Neovaskularizace Model angiogeneze - interakce buněčných typů. V nádorových buňkách prostaglandiny (PGs) tvořené přes cyklooxygenázu-2 (COX-2) zvyšují produkci růstových faktorů jako je VEGF, které působí přímo na endoteliální buňky a bFGF, který stimuluje produkci COX-2 u fibroblastů. PGs tvořené ve fibroblastech stimulují produkci VEGF, který působí parakrinním způsobem na endoteliální b. a opět zvyšuje aktivitu COX-2 a usnadňuje permeabilitu cév a angiogenezi. Inhibitory COX-2 blokují produkci PGs a tak zabraňují angiogenezi indukované růstovými faktory. r Stupeň angiogeneze jako prognostický faktor Úzký vztah mezi angiogenezí a tvorbou metastáz. Čím intenzívnejší angiogeneze, tím větší riziko metastáz a horší prognóza nádorového onemocnění. Histologické řezy a detekce fekálních oblastí tzv. „hot spots" pomoci monoklonálních protilátek proti cévnímu endotelu nebo adhezívním molekulám CD31 a CD34. Kvantitativní hodnocení je prognostickým faktorem např. u rakoviny prsu, děložního čípku, močového měchýře a melanomu. Zvýšená vaskularizace kostní dřeně - horší prognóza u akutní leukémie. Inhibice angiogeneze - léčebná metoda Antiangiogenní terapie - výhody proti terapii mířené přímo proti nádorovým buňkám. Endoteliální buňky jsou geneticky stabilní, diploidní a homogenní cíl a zřídka zde dochází k mutacím. Také jejich obnova je 50 krát vyšší než v normální klidové tkáni a aktivované krevní cévy vykazují specifické markery jako jsou integriny a selektiny nebo VEGF receptory. Hustota cév uvnitř nádoru má také prognostickou hodnotu. Byla nalezena pozitivní korelace mezi nádorovou angiogenezí a rizikem vzniku metastáz, znovuobnovení nádoru a smrtí. ♦ inhibitory buněčné invaze, motility a adheze (inhibitory MMP aktivity, inhibice buněčných adhezívních molekul) ♦ inhibitory aktivovaných endoteliálních buněk (trombospodin-1 - fyziologický inhibitor angiogeneze, který je snížen během aktivace angiogeneze a jeho produkce je regulována p53, angiostatin a endostatin - zdrojem jsou samotné nádorové buňky, uměle syntetizované látky (talidomid) ♦ látky, které interferují s angiogenními růstovými faktory a jejich receptory (specifické protilátky, INF-alfa ♦ inhibitory enzymů jako je COX-2 (NSAIDs) ♦ tzv. "vascular targeting" - inhibice růstu nádoru destrukcí nádorových cév. Endogenní inhibitory angiogeneze Table I. Some endogenous inhibitors of angiogenesis Name Description Thrombospondin-1 and internal fragments of thrombospondin-1 Thrombospondin is a 180 kDa, large, modular extracellular matrix protein (53) Angiostatin A 38 kDa fragment of plasminogen involving either kringle domains 1-3, or smaller kringle 5 fragments (58,163,164) Endostatin A 20 kDa zinc-binding fragment of type XVIII collagen (59) Vasostatin An N-terminal fragment (amino acids 1-80) of calreticulin (61) Vascular endothelial growth factor inhibitor (VEGI) A 174 amino acid protein with 20-30% homology to tumor necrosis factor superfamily (60) Fragment of platelet factor 4 (PP4) An N-terminal fragment of PP4 (63) Derivative of prolactin 16 kDa fragment of the hormone (57) Restin NC10 domain of human collagen XV (165) Proliferin-related protein (PRP) A protein related to the pro-angiogenic proliferin molecule (166) SPARC cleavage product Fragments of secreted protein, acid and rich in cysteine (62) Osteopontin cleavage product Thrombin-generated fragment containing an RGD sequence (65) Interferon a/ß Well known anti-viral proteins (56) Meth 1 and Meth 1 Proteins containing wetalloprotease and /hrombospondin domains, and disintegrin domains in NH2 termini (65) Angiopoietin-2 Antagonist of angiopoietin-1 which binds to tie-2 receptors (39,44) Anti-thrombin III fragment A fragment missing C-terminal loop of anti-thrombin III (a member of the serpin family) (64) Inhibitory angiogeneze v klinických zkouškách □rug S-DÚP-90I M-iLli.iriiim COL ] 3 ij u lij nun* C^ib^lHťlHlini CalIlQffWI, MCI M * g A1111 rf. 0. ErdDilJhn NCLEntrúMud r;^.i Novirlii SvnĽWTlú UMP Inhůnw; E-plr*zfcWnn rinriirtfliirfl InhlblCa. NliH ÉKĹhÉii^n-Ap*rfnm\m m príllťtrnling cndDtfMllum ftkf cki VEGF rDMjitor vgiiůllnQ IndiKtbn dndalhclljl call Inhibrtnr aŕ cnlcliim Inllui 9rinJI rttůlKull inhlbJMr al Ph*» u Nwirlll EjTilhttk: yjJP inrubhůr TNMW TAP Phörm. F. li.141hl- .11 :'-.-4iii: ■ nhiblll PPdPl^liOl rhjlldomlda Unknown EUS41B Blwla VEQFřůLtpioi signaling An 11 bod y lainlnnrln OH pnťílht" .il qnrMCQ iii!'.-iiMikii-.i; inducqq IFrf-gnmm-i j.-.d IP-1D EUD1SV9TI UůTCk. QMTTiifiľ mnI imIdĺuIú Integiln .M-riifG*llt1 _ j Phase III Brlllnh- Blolnrti Syniíinllc MVPInhiblIa- AGJ34D íyncfiÉilĹ MUP Irtriiblit» NúúvillälrtEUI AůBVTIIJ HHutéI UMP Ud UEgFP. Imiibllsr AiiCi-VEGF AI: LlU^lünll «nllb^y