Proteomický experiment



  PŘÍPRAVA VZORKU

  solubilizace   močovina, thiomočovina, detergenty

  redukce         DTT, TBP
  inhibice         proteáz, fosfatáz, gykosyláz
  odstranění kontaminant

DETERGENTY



žádný celkový náboj

0.5 – 4%

použitelné ve vysokých koncentracích močoviny



•            neionogenní

•            zwitterointové



SDS jen v nízkých koncentracích (do 0.25%)







ZÁKLADNÍ PRAVIDLA

§    zabránit proteolýze

§    jednoduchý postup

§    čerstvé reagencie

§    čerstvý vzorek

§    odstranit pevné částice - centrifugace

§    odstranit kontaminanty

                                           KONTAMINANTY

§    soli, zbytky pufrů

§    malé endogenní molekuly

§    iontové detergenty

§    nukleové kyseliny

§    polysacharidy

§    lipidy

§    fenolické látky







2-DE

1. ROZMĚR      IZOELEKTRICKÁ  FOKUSACE

migrace nabitých částic v gradientu pH v elektrickém poli





ROZSAH STRIPU
ROZMĚR STRIPU





EKVILIBRACE STRIPU

2. ROZMĚR      SDS-PAGE
migrace aniontů v elektrickém poli podle MW





BARVENÍ PROTEINU V GELU

BARVENÍ PROTEINU
LINEARITA



ANALÝZA OBRAZU



                                          2D or not 2D ?

•             rozlišení

•             vizuální aspekty

•             multigelové jednotky

•             dynamický rozsah

•             extrémní proteiny (membránové,basické...)

•             reprodukovatelnost, image analýza

•             citlivost barvení

•             pracnost

•             nesnadná automatizace

•             postdigesční extrakce



                                MULTIDIMENZIONÁLNÍ  CHROMATOGRAFIE





                                    Biomarkery v lidské plasmě



separace                         identifikace











KERATINY ! ! !  Potlačení ionizace





                                            LITERATURA















                                          PREFRAKCIONACE

PREFRAKCIONACE
MIKRO ROZSAHY