Regulation of embryonic stem cell self-renewal by phosphoinositide 3-kinase-dependent signaling
Paling NR Wheadon H Bone HK Welham MJ
Department of Pharmacy and Pharmacology, Centre for Regenerative Medicine, University of Bath
Prof Melanie J.Welham
Receptorový komplex pro cytokiny rodiny IL-6
IL-6 cytokiny:
interleukin 6 (IL-6), interleukin 11 (IL-11), leukémii inhibující faktor (LIF), kardiotrofin-1 (CT-1), ciliární neurotrofický faktor (CNTF), onkostatin M (OSM), kardiotrofinu podobný cytokin (CLC). neuropoietin (NP)
LIFRß
gpi30
IL-6R
CNTFR
CT-1 R
IL-11R
Vazba ligand + receptorový komplex spouští několik paralelních signálních drah
(FXSTAT1/3J
FGF PDGF
"6( STAT3 '} (_ GTAT3 jF
.STAT3 1^
gpi30
I-^(P) SHP2";
SHP2P
Gab PI3K
P
í
1		Ras/ERK		Akt
	1			
PI3K
Dráha SHP2 / PI3K
SHP2-Grb2-Gab1 - PI3K-PIP2^PIP3 - translokace Akt, PDK1—>Akt - Mdm2, IKK, mTOR
inhibice GSK3
Wnt dráha - přítomnost ligandu —► inhibice GSK3
S6
Absence of Ligand
Frizzled
Dsh
CKIa GSK3ß Axin
I
APC
p/77 p p p
Ubiquitination and Degradation
Groucho
TCF
CBP
r1
target genes repressed
Presence of Ligand
APC
CKIa
GSK3ß
v J       v___J
TCF r
target genes activated
Inhibice PI3K
PI3K:
Regulační doména - p85a
Katalitická doména - p110a, p110(3 a p1105
LY 294002 - blokuje vazebné místo pro ATP
Dominantně negativní mutant - Ap85 - Tet OFF expresní systém
- chybí vazebné místo pro p110 Buňky E14tTA exprimují Tet - senzitivní transaktivátor
Genová exprese regulovaná tetracyklinem
a Systém tet-off —
tlA
Eunéčne-specľflcký promotor +
tTA = tetracycline transactivatcr - hybridní protein složený z tetracyklincvého represoru (gen = červená) a transkripčního aktivátoru (gen = modrá)
-Dox
Dm-tTA
s
s
Přidání Dox vypíná expresi transgenu
Dox = doxycyklin
Navázání tTA na promotor je nezbytné pro —^        aktivaci transkripce transgenu
:eíO   jr Trdllí
b Systém tet-on
	WĚ-	—K^M-I 1   ... L.
gene		tet O   p Transit
		
		
i_
Násobné sekvence tetracyklinového operátoru + silný eukaryotický promotor
Přidání Dox zapíná expresi transgenu
tetO p
Tranigene
řňfO p
rtTA = reverse tetracycline-control ed transactivatcr syslém - nukleotidevá sekvence rtTA   teTacyklinového represoru obsahuje mutaci zabraňující jeho vazbě na tetO; k vazbě dojde po interakci s Dox.
Transgene
O co se tým snažil
? Aktivuje LIF PI3K?
? Jak ovlivňuje inhibice PI3K sebeobnovu mES?
? Jak ovlivňuje inhibice PI3K aktivitu STAT3 a Erk1,2?
? Jak ovlivňuje sebeobnovu inhibice PI3K a MEK?
? Jak ovlivňuje inhibice PI3K hladinu a fosforylaci p-cateninu
«-pS473 PKB «-panPKB
0     5    10   30 LIF(mins) - +   ' + ' +'t.LY294002 -    - W"7k-pPKB
PKB
0 10 20 30 60 LIF(mins) +-+-+-+-+ LY294002
a-pPKBsub
a -pGSK-3 a-SHP-2
-    -   •   - |*pS6
hpGSK-3
SHP-2
Obr. 1
B
a-pPKBsub a-pGSK-3 a-p85 a-SHP-2
Basal   0   10   30   45 60 LIF(mins) + ■ + - + - + - + - +- - Tet
*pS6
*pGSK-3
^_Ap85 ^p85
<4 SHP-2
C 2 10 2
a-pS473 PKB
a-panPKB a-p85
Basal + - Tet
a-pY
pPKB
PKB
200-
116-
97^
66-
i^Ap85 97-rp85    a-P85 66
;;it
«p85
CM
■
.q
O
s
V
[
I
V
[
V a.
[
CD
■ □ ■ □
sa
it
CO
sse)E?i|dsoifd au i pen i e %
I
1
*
o
J
>-_i
+■
1
'j
+
SGOUOIOO SAUlSOd
aseiei^dsoLid suneme %
Obr. 4
	3     4 5	Day
	-+- + - +	LY294002
rt-Oct-4	____-	^^—Oct-4
(I-STAT3	----\4— STAT3	
C-STAT5		4— STATS
f:-SHP-1	- *	A—SHP-1
B
^pSTAT3 U-STAT3
0    5   10   15  20  30 LlF{mins)
_ +       .+ -+.+ .+ LY294002
(-pSTAT3
STAT3
Q       Basal  0    10   30   45 60 LIF(mins) + -+ - + - + -+ -+ - Tet
a-pSTAT3 a-STAT3
a-p85
pSTAT3 -STAT3
i^_Ap85
Obr. 5
0    5   10    15   20 30
- + - + - » - + - +
(t-
LIF (mins)
LY294002 pERKl pERK2
ERK1 ERK5
B
Tet
a-pERK
rt-pERKI N-pERK2
a-ERK
ERK1 ERK2
a-p85
m o
^< CO
o o m
o
9
GO
—I
GO
I
I
1
I
T I
a
i
CO —I
>
I
T
Go —I
—I
CO
CD
m
XI
■ j 2 m m M
ro —^
% alkaline phosphatase positive colonies
ooooooooooo
	1	1	■ +
If	1	+	+ +
1	+	+	+ ,
1	+	1	1 1
1 1	1	1 +	■ + 4- +
%	+	+	+ ,
1	+	1	1 i
3-
I
+ + + i
r ^
I
>
o <
% alkaline phosphatase positive colonies
Obr. 7
a-pS33/37 T41
p-catenir
a-pan
fJ-catenin rx-SHP-2
E14
E14Ap85
0 10 20 30 60 LIF(mins) - + - + - + - +  - +LY
B 0 1Q 30 45 LIF(mins) + - + - + - + - + - Tet
p-p-catenin -p-catenin
"SHP"2 a-pÖ5
4- p-p-catenin +p-catenin
B
a-pS33/37T41 p-catenin
tx-pan p-catenin
a-pPKBsub a-SHP-2
E14
D4   D5 D6 + ■ + ■ * LY
p-ß-catenin
■p-catenin -pS6 SHP-2
E14Ap85
D1   D2 D3 + - + - + - Tet
p-p-catenin p-catenin
a-p85
p85