BIOSENSORY Co to je biosensor? Elektrochemické enzymové sensory Biosensory pro měření glukosy Optické afinitní biosensory Imunosensory DNA biočipy Budoucí trendy Biosensor je analytický přístroj ... obsahující citlivý prvek biologického původu v těsném kontaktu s fyzikálně-chemickým převodníkem. Poskytuje elektronický signál úměrný koncentraci stanovované látky. A ♦A převodník (transducer) elektronická jednotka výstupní signál biorekogniční vrstva analyt = látka, která se stanovuje i Biorekogniční složka rozpoznává stanovovanou látku, kterou buď: specificky přeměňuje = biokatalytická reakce: - enzym, organela, buňka, tkáň, orgán, organismus nebo specificky váže = bioafinitní reakce: - vazba protilátek s antigény (hapteny) hybridizace nukleových kyselin vazba ligandů na receptory interakce sacharidů s lektiny Fyzikálně-chemický převodník převádí biorekogniční reakci na signál vhodný pro další zpracování: elektrochemické (potenciometrie, amperometrie, konduktometrie, voltametrie) optické (fotometrie, fluorimetrie, luminometrie, nelineární optika) piezoelektrické a akustické elektromagnetické kalorimetrické (nano)mechanické 2 Podmínky měření s biosensory přímo ve sledovaném prostředí - řeka, tkáň, krevní řečiště, potravina, nápoj, fermentor,..." Přímý kontakt se vzorkem m přídavky ▲ vzorků v nádobce - temperovaná, míchaná - vyčká se ustavení pozadí signálu v pracovním roztoku - přidá se vzorek a po ustálení se odečte signál - přídavky vzorku lze opakovat. Měření v nádobce v průtočné cele Průtočné měření s biosensory střídavě se nechá protékat zóna základního roztoku a zóny vzorku (A) - měřený signál je tedy vyvolán přímo neředěným vzorkem neustále protéká pracovní roztok, do kterého se nastřikují vzorky - FIA, flow injection analysis - přitom dojde k definovanému naředění vzorku a signál má charakteristický tvar píku (B) - vyhodnocuje se buď jejich výška nebo plocha Amperometrické sensory heterogenním přenosu elektronů mezi elektrodou a redoxním párem molekul signál = proud úměrný koncentraci analytu proud I se měří při konstantním napětí (potenciál E) pracovní elektrody velikost proudu prošlá za daný čas t v systému udává náboj Q, který odpovídá molárnímu množství látky přeměněné na elektrodách: Q = 11 = n F m / Mr F = 96487 C/mol značí Faradayovu konstantu k elektrochemické oxidaci látek dochází na anodě (I > 0), redukční děje (I < 0) probíhají na katodě. směr proudu je totožný se směrem toku pozitivních ekvivalentů (nábojů) Potenciostat moderní digitální konstrukce - analogový obvod řízený A/D (sběr dat) a D/A (nastavení excitačního potenciálu) w o— R 2t A O- POTENCIOSTAT t 1 D/A A/D 4 * POČÍTAČ Měřící us pořádání . Pár- '$| mikroprocesorem řízený osmikanálový potenciostat, výstup dat na externí počítač přes RS232 rozhraní 4 Měření kyslíku a H20 Clarkův sensor Au (Pt) elektroda zatavená ve skle Ag/AgCI elektroda elektrolyt y. membrána šl propustná pro 02 výhodou je prakticky absolutní specifita pouze ke kyslíku - rušivé látky nemohou projít membránou Konstrukce elektrody pro stanovení u je podobná kyslíkové s tím rozdílem, že není použita plynopropustná membána a používá se pozitivní polarizace, při které nastává anodická oxidace peroxidu Elektrodová redukce kyslíku (-750 mV) je čtyřelektronový proces: 02 + 2 H20 + 2 e-H202 + 2 e- ------- H202 + 2 OH- 2 OH- Elektrodová oxidace peroxidu vodíku (> 600 mV): 2H20 2 HoO + Oi + 2e+2H* Membrány a biosensory mechanická \ kontrola transportu | \ imobilizace převodník ŕ -.. ■ ^^^^íŕ**31^^ -00mi ; ■:-:,: ' ^ja^vj• ŕ■ ■ ■'■:;v:f-;-ľ-:';?■'■■ ^;■'iil^tai^ membrány v biosensorech plní několik funkcí: imobilizace biorekogničních molekul - nosná funkce řízení transportu látek buď prostřednictvím difúzni kontroly nebo ovlivněním selektivity zlepšenímechanické stability biokompatibility Enzymové elektrody s oxidasami oxidují molekulu substrátu (analytu) za účasti kyslíku, vzniká buď peroxid vodíku nebo voda: substrát + 02 --------► produkt + H202 substrát + 02 --------► produkt + H20 detekce peroxidu je obecně citlivější (nulová výchozí hladina) oxidace peroxidu vodíku je spojená s nebezpečím interference ze strany jiných oxidabilních látek, napr. v séru mohou vadit kyseliny askorbová a močová či paracetamol specifita se dá zlepšit předřazením kontrolní membrány, která omezí přístup interferujících látek Někdy jsou b lio sensory příliš dobré... ■ ■*■ ^^H ■ -- H 9 i ■A •> • glukosový / laktátový sensor - přední měřící a zadní kontaktní pohled • trvanlivost příliš dlouhá - potřeba omezit „životnost" - přidání obvodu počítajícího provedené analýzy, - po dosažení stanoveného počtu ukončení použitelnosti - integrovaný inkrementální čítač (1-wire counter) Přenos elektronů z biomolekul substráty produkt H^^PTT^BH ox\/ \ A« / ,w,ox 5)J ferrocen Fc (X) pro usnadnění výměny elektronů mezi enzymy a |l /=( I elektrodou se používají nízkomolekulární redoxní ^s s^ látky - mediatory použití mediátorů urychluje a obvykle vůbec tetrathiafulvalen umožňuje výměnu elektronů mezi aktivním centrem jjf enzymu a elektrodou ■ NCN / mohou být přímo součástí tetrakyanochinodi-methan TCNQ 15 Regulace hladiny glukosy hype/g|ykemie * % diabetik normální stav hypoglykemie **■ 8 12 snídaně oběd 19 8 hod večeře spánek snídaně Denní průběh hladin krevní glukózy v oblasti klinické biochemické analýzy zůstává stále středem zájmu měření hladiny glukózy u diabetiků regulace je u diabetiků porušena a musí se docílit vnějším podáváním insulinu dávkování vyžaduje znalost aktuální hladiny glukosy - pacienti jsou nuceni několikrát denně měřit glykemii velmi dobré uplatnění biosensorů Biosensory pro diabetiky první osobní glukometr na bázi výměnného elektrochemického biosensorů představila firma MediSense ExacTech - velikost psacího pera do kterého se zasunovaly měřící pásky najedno použití Companion - formát karty MediSense nyní patří do skupiny Abbott Laboratories, současný její glukometr je distribuován pod názvem Precision QID proti předchozím verzím potřebuje nyní pro analýzu pouze 5 mikrolitrů krve, takže pacient je méně zatěžován. 9 Hlavní cíl do budoucna: implantovatelný biosensor pro měření in vivo přímé řízení pumpy dávkující kontinuálně insulin podle okamžité potřeby pacienta výsledky vývoje prováděného paralelně asi na desítce různých pracovišť v celém světě nadějné - po implantaci fungují biosensory až 100 dnů komerční systém dosud není k dispozici problémy jsou zejména se spolehlivostí a dostatečně dlouhou operační stabilitou 10 Laboratorní klinické analyzátory přístroj firma glukosa + analyty • AUTOSTAT Daiichi (Japonsko) • EBIO Plus Eppendorf / BST (Německo) laktát, citrát, vit. C • Enzym at Seres (Francie) sacharóza, alkohol • ESAT PGW Medingen (Německo) laktát • EXSAN (Litva) laktát • GLUCO Fuji Electric (Japonsko) • i-Stat I-Stat Corp. (USA) močovina • Model 860 Ciba Corning (USA) • NOVA 16 Nova Biomedical (USA) močovina, kreatinin • Satellite G MediSense (USA) • YSI SELECT Yellow Springs Instr. (USA) laktát, etanol, cholin Většinou se jedná o malé stolní přístroje, často doplněné zásobníkem vzorků 1 i-STAT předpoklad: analýza vzorků v místě jejich odběru (operační sál, lůžko pacienta) může podstatným způsobem zkrátit dobu do získání výsledků lze tedy urychleně provést kroky vedoucí ke zlepšení stavu pacienta decentralizované měření multikanálový elektrochemický biosensor, poskytující informace o klíčových látkách, analyzovaných při krizových situacích pacientů základní modul najedno použití obsahuje měřící sensory, zásobní roztok standardu a prostor pro nakápnutí vzorku krve n ** A*»1J, 141 |wi, -----r- JB^M m TCOľ—i. —■—--1 H tí U H n . —f--------' Gl U «f/41 —i--------' Het tu. - ^^ —i-------- #4**44*I27e IZ41 Q4WA. i-STAT po nakápnutí vzorku krve se měřící modul zasune do přístroje vyčká se zobrazení výsledků měřící modul je na jedno použití 12 Měření inhibice enzymů inkubační oostui 1. výchozí signál . 2. inkubace se vzorkem 3. promytí sensoru s ' 4. zbytkový signál \ | kontinuální měření 1. odezva na substrát, 2. ustavení ustáleného stavu 3. přídavek vzorku 4. měření poklesu signálu inkubace se AI ' vzorkem * .A s\ jJ VZOI rek 13 RinNA Biochemical DIU M n Nerve Agent Detector ] osobní detektor nervově paralytických látek ve vzduchu detekované látky rychlost odezvy: : typ "G" and "V", limit detekce ve vzduchu: 1 ng/L 30 s (15 s pro 10 ng/L) hmotnost: 500 g rozměrv: 120 x 80 x 35 mm - signalizace alarmu: vizuálně / akusticky I^BHB kontrolní jedrn »tka i j pu®ß^ Afinitní biosensory molekulární reakce mezi: antigen protilátka hormon receptor léčiva receptor enzym kofaktor / substrát / inhibitor receptor mikroorganismus / buňka nukleová kyselina vazebná bílkovina nukleová kyselina komplementární řetězec 14 Afinitní biosensory ■jeden z afinitních partnerů imobilizován na povrchu převodníku; podle generování signálu se rozlišují: ■ přímé afinitní biosensory - vznik biokomplexu je možné sledovat v průběhu afinitní interakce (v reálném čase) -jako převodníky slouží speciální optické světlovodné systémy, piezosensory nebo impedimetrická zařízení i nepřímé afinitní biosensory -jeden z afinitních partnerů je vhodně označen, na konci interakce se pak stanoví množství značky navázané na povrchu sensoru - podle typu značky (enzym nebo fluorofor) se použije převodník vhodný pro měření enzymové aktivity nebo fluorescence Schéma měření 1. imobilizace ligandu 2. asociace se vzorkem 4. regenerace tó Wím 3. pufr disociace mm 15 Konfigurace SPR hranol DAD LED, laser „surface plasmon resonance" pro zavedení světla se používá vstupní hranol, povrchová vlna se excituje na rozhraní mezi kovem M a dielektrickou vrstvou C (vzorek) změna resonance se zaznamená jako posun minima intensity pomocí detektoru - diodové pole SPR signál Vazebná reakce => změna resonančních podmínek Intensita odraz, paprsku úhel odrazu a resonanční úhel odpovídající minimu intensity odraženého paprsku je kontinuálně vyhodnocován, jeho poloha je úměrná změnám povrchové hmotnosti vyvolaným adsorpcí biomolekul 16 SPR hapten VttttVWfr .^> <*& «#g immobilized antibody angle 0 , buffer wash SPR angle ------- J ■tttW hapten solution schéma záznamu signálu 3 f r Signal vs Pixel Ö + l — 1 1.025G 1 0.G31S2 v 1 |1. i 256. T Smooth iTlstDeriv. Statistics 1 RescaleJ Un-Zoom 11 SPR biosensor výměnný biosensor - „čip" systému BIACORE i^^* gen*nrChip S*HWfChlŕ BI CMS CM4 PIONEER | BIACORE 4 BIACORE V1AĹOK \ Rozměry 9x2.5x0.1 cm Modifikace povrchu: s x 2.5 x CM5 karboxymethyl-dextran, HPA hydrofobn í, SA streptavidinový, NTA komplexace kovů 17 18 BIAcore 'microfluidics' system - miniaturní výměnný modul s ventily přívod pracovního pufru, reagencií a vzorků k jednotlivým měřícím kanálům Surface plasmon resonance SPREETA - sensor Id mirror fil gold sensor filr polarizer LED and ape? . clear material linear silicon photo-diode array -128 elements Texas Instruments, www.ti.com/spreeta Chemické m i kro vážky -piezoelektrické biosensory kovové elektrody objemová akustická vlna schéma tloušťkové střihové vibrace základní stav / ar Hmotnostní citlivost: QCM - quartz crystal microbalance kontakty^ držák destička z křemene AT-řez 5 až 20 MHz Piezoelektrický krystal -2f 02 Am 20 Rigidní a viscoelastické vrstvy tenký rigidní film: horní i dolní povrch vibrují synchronně viskoelastický film: horní i dolní povrch vibrují s fázovým posunem - větší tlumení, „větší" odezvy MU Brno Real-time recording of the resonant frequency changes sample PZ detector computer flow-through cell with PZ crystal The change Afof the resonant frequency f0 of piezoelectric crystals is proportional to the mass change Am (Sauerbrey's equation): A/ = - 2f02Am 21 Ukázka kinetické analýzy MA 5 ug/ml 0.0006^ kobs (s1) 0.0004 kd= (0.0000297 +/- 0.000017)1; k = (2460 +/- 98) I mök1 100 200 300 [MAb] (nmol/l) Studium interakce protilátky s imobilizovanym haptenem pomocí piezoelektrického biosensoru ELISA-on a strip Absorption „^ pad Signal generation pad Conjugate- Sajnplc^--applicatiun pad Control antibody K v. Capture ajilibody% _*®'-. Detection antibody-J conjugate HRP 0 0.25 2.5 25 5 mm Front Side imunostripy - samovolný pohyb roztoků v membráně pomocí kapilárních sil záchytné zóny, zviditelnění pomocí barvotvorné enzymové reakce, případně zlaté nanočástice (červené) vizuální vyhodnocování 1 ' ^ ! 1 r -mÁ \ í Charging «quipOKttt ^— * r^ Elektrochemická imunostanovení *,BA« Á" 1. Inkubace se vzorkem a s tra cere m" ^ Í Enzym 1 %^ ■■ lil **^#%* ■ \* ■■■ 2. Separace, promytí í A ^^ Enzym V 3. Přídavek substrátu (inkubace) 4. Změření signálu Imunosensory - enzymové značky peroxidasa (HRP) - substráty - vždy peroxid vodíku plus další oxidovatelné látky: - 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) měření fotometrický při 450 nm - 2,2'-azino-di(3-ethyl)benzthiazolin sulfonová kys. (ABTS) při 650 nm - 5-aminosalicylová kyselina (ASA) při 450 nm - elchem: jodid, hydrochinon, ferrocen, ASA, ... alkalická fosfatasa (ALP) - p-nitrofenylfosfát (PNPP), hydrolysou vznikající p-nitrofenol se stanovuje fotometrický v alkalické prostředí kolem 405 nm - p-aminofenylfosfát (PAPP), vzniklý aminofenol se oxiduje na elektrodě ß-galaktosidasa - o-nitrofenyl-ß-D-galaktosid (ONPG), hydrolysou vzniklý o-nitrofenol se měří při 420 - močovina, změna pH vyvolaná hydrolysou se měří pomocí indikátoru bromkresolová modř při 588 nm, nebo potenciometricky (LAPS) glukosa oxidasa - velmi stabilní, měří se generovaný peroxid vodíku acetylcholinesterasa - vysoké číslo přeměny Imunosensory - fluorescenční značky fluorescein, tetramethylrhodamin - klasické, dostupné v aktivované formě (NHS, biotin, ...) Cy5, Cy3 - cyaniny, NIR 650/667 nm - levná instrumentace QD „quantum dots" - anorganické nanočástice obsahující volné elektrony, s velikostí narůstá vlnová délka emise, stabilita a vysoké výtěžky, velké Stokesovy posuny 24 Elektrochemiluminiscence kulička (zvětšeno) X + analyt ve vzorku mg. kuličky potažené streptavidinem BioVeris technologie: rychlý "mix and measure9 homogenní formát ^CL reakce Luminiscence emise světla Chemi- předání chemické energie Elektro-elektrochemická iniciace Ru(bpy}3!+(1) = BV-TAGTg TPA = Tri propylamine ruthenium a TPA jsou oxidovány po aplikaci napětí na elektrodu TPA+ ztrácí proton, redukuje Ru3+ na Ru2+, které z excitovaného stavu přechází do základního za vyzáření fotonu Ru se nespotřebovává - recykluje - zesilovací mechanismus -zvýšení citlivosti stanovení 25 Různé formáty stanovení Paramagnetic 6ead imuno 1Enl7ed) Paramagnetic Bead í Tyf aíwnatle tide chain Imunosensory - co lze měřit teoreticky každý analyt, pro který ... -jsou k dispozici příslušné protilátky - případně již existuje ELISA stanovení - lze připravit protilátky klasickými postupy - lze připravit rekombinantní protilátky pomocí genetické knihovny 26 Imunosensory - příklady stanovení klinická oblast - markery: albumin, apolipoprotein, hCG, hLH, thyroxin, fetoprotein, hlgE, troponin, FABP, PSA, HBsA, ... - léčiva: amfetamin, digoxin, fenytoin, theophylin, ... - drogy: kokain, heroin, ... životní prostředí - pesticidy: triaziny (atrazin), fenoxyalkanové k. (2,4-D), organochlorové (acetochlor, DDT) - toxické látky: mikrocystiny, polychlorované bifenyly (PCB) potravinářství - bakterie: Listeria, Cryptosporidium, Salmonella, E. coli 0157H7 - kontaminanty: antibiotika (penicilín), aflatoxiny vojenství - bakterie, viry, toxíny DNA čipy I. cDNA (500~5000 bází) je imobilizována na pevný povrch (sklo) a exponována souboru cílových sekvencí buď separátně nebo ve směsi Vyvinuto Stanford University, „DNA microarray" II: používá se soubor oligonukleotidů (20~80-merů) nebo peptidových NA (PNA) prób precizní technologie, srovnatelnost výsledků krátké próby - menší specifita a citlivost; vysoká cena Vyvinula firma Affymetrix, „GeneChip" 27 Rozměry elementů mmwl 1 i*pTyBJPppw*p[tB k plátek křemíku (wafer, 5x5 inch, tj. 12.5x12.5 cm) z něho 49 až 400 jednotlivých sensorů (chips, 1.28x1.28 cm) na každém čipu až 1.4 milionu pozic (features, 11x11 pm) v každé pozici několik milionů kopií stejné oligonukleotidove próby s danou známou sekvencí cDNA arrays (Stanford) Control Call Experimental Cell © © ^^-"^ mRMA ^-^s. ^^^r eklnactarJ "*^C from cell * ♦ RevefEB transcription, _pH^--^^ tluorescently labeled _^1) -^S£ with Cy3 (Green) andCy5