Úloha č.2 – Stanovení enzymů A) URČENÍ JATERNÍCH ENZYMŮ – ALT, AST Poruchy metabolismu jater se projevují ve změnách koncentrací některých nízkomolekulárních látek (typicky bilirubinu) v krevním séru a zejména hladin některých enzymů. Bilirubin, který se tvoří v RES převážně z hemoglobinu, je špatně rozpustný, a proto je tělními tekutinami transportován do jater vázaný na albumin (nekonjugovaný bilirubin). V buňkách jaterního parenchymu se na jednu nebo obě propionové kyseliny bilirubinu váže kys. glukuronová - tzv. konjugovaný bilirubin. Kromě obvyklé reversibilní vazby se může bilirubin vázat na albumin kovalentně (D‑bilirubin), který koluje v organismu, dokud nedojde k vyloučení samotného albuminového nosiče z organismu. Obsah konjugovaného bilirubinu se zvyšuje zejména při závažných chorobách jater (ikterus), zvýšená hladina nekonjugovaného bilirubinu je známkou zvýšené hemolýzy. g-glutamyltransferasa (GGT, GMT) je enzym vázaný na membrány, typický pro orgány parenchymového typu – vyskytuje se zejména v ledvinách, pankreatu a játrech. Pro klinickou praxi má význam prakticky jen enzym z jater a žlučových cest, které mají charakter cholestase (např. obstrukce žlučových cest); je to jeden z hlavních ukazatelů požití alkoholu. Aminotransferasy (transaminasy) ALT (GPT) i AST (GOT) jsou velmi důležité pro diagnostiku jaterních nemocí. Aktivita AST v séru bývá zvýšena i při jiných chorobách zejména při infarktu myokardu. Z poměru aktivit ALT a AST je možné usuzovat i na hloubku poškození orgánů – ALT je cytoplazmatický enzym, zatímco AST je lokalizován v cytoplazmě a zčásti v mitochondriích. Úkol: Stanovte aktivity obou enzymů (ALT, AST) ve vzorku kity Bio-la-test fy Lachema. b) Stanovení enzymové aktivity alkalické fosfatasy Alkalická fosfatasa v séru pochází především z kostní tkáně (osteoblastů) a mikrosomů jaterních buněk, její aktivita v séru stoupá v důsledků nemocí těchto orgánů. Jako jeden z mála enzymů je alkalická fosfatasa vylučována žlučí do trávicího traktu, její zvýšená hladina v séru tedy může indikovat sníženou průchodnost žlučových cest (cholestasis). Aktivita tohoto enzymu se určuje nejčastěji na základě jeho schopnosti štěpit syntetický substrát p‑nitrofenylfosfát, produkt p-nitrofenol má intenzivní žluté zbarvení. Úkoly: Změřte aktivitu alkalické fosfatasy několika níže uvedenými způsoby, současně posuďte vliv aktivátoru a inhibitoru. Reagencie: roztok 1: 5.5 mM p-nitrofenylfosfát v glycinovém pufru roztok 2: 5.5 mM p-nitrofenylfosfát + 1 mM MgSO[4] v glycinovém pufru roztok 3: 5.5 mM p-nitrofenylfosfát + 0.1 M KH[2]PO[4] v glycinovém pufru 1. Dvoubodové stanovení Postupujte podle následujícího schématu : vzorek blank roztok substrátu (roztok 1) 1 ml 1 ml sérum 0.1 ml – inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě 0.02 M NaOH 10 ml 10 ml sérum – 0.1 ml Po promíchání změřte absorbanci proti blanku při 400 nm. Současně proveďte stanovení s aktivátorem – Mg^2+ ionty (roztok 2) a inhibitorem – fosfátem (roztok 3). Vypočtěte aktivitu alkalické fosfatasy v katalech, jestliže extinkční koeficient e = 18.8 mM^–1.cm^–1. Posuďte vliv inhibitoru a aktivátoru. c) Izoenzymy laktátdehydrogenasy (LD) Pro diferenciální diagnostiku poruch různých orgánů má velký význam posouzení aktivit některých orgánově selektivních enzymů a zejména izoenzymů. V této úloze je demonstrován jeden z přístupů používaný při analýze izoenzymového spektra v krevním séru – při stanovení laktátdehydrogenasy (LD, LDH) je využito odlišné substrátové specifity izoenzymů. V jiných případech lze využít např. specifické inhibice jednoho izoenzymu protilátkou (kreatinkinasa). Tetramer LD vytváří 5 izoenzymů kombinací dvou typů podjednotek H (heart) a M (muscle): LD[1] (H[4]), LD[2] (H[3]M), LD[3] (H[2]M[2]), LD[4] (H[3]M) a LD[5] (M[4]). K separaci a kvantifikaci jednotlivých izoenzymů se používají elektroforesa, ionexová chromatografie, resp. imunoprecipitace; jinou možností je právě využití různé substrátové specifity těchto izoenzymů. Distribuce izoenzymů v krevním séru: LD[1] 18-33 %, LD[2] 28-40 %, LD[3] 18‑30 %, LD[4] 6-16 % a LD[5 ] 2-13 %. Izoenzym LD[1] je vedle laktátu schopen poměrně účinně oxidovat i 2-oxobutyrát (a-hydroxybutyrát), chová se tedy jako a-hydroxybutyrátdehydrogenasa (HBD). Tento izoenzym se vyskytuje především v srdeční tkáni, jeho stanovení má hlavní význam při diagnostice infarktu myokardu. V játrech a plících je tohoto izoenzymu poměrně málo, nezanedbatelné aktivity však lze najít i v kosterním svalstvu, ledvinách a erytrocytech. Úkoly: a) Stanovení celkové aktivity LD v séru Proveďte stanovení celkové aktivity LD pomocí kitů fy Lachema (Bio-la-test) či Chemelex. b) Stanovení HBD v séru Při vlastním stanovení postupujte podle návodu v setu fy Sevac či Reanal. Vyhodnoťte podíl izoenzymu LD[1] na celkové aktivitě LD ve vašem vzorku.