ITP Stanovení kyseliny glutamové Kyselina glutamová Model molekuly kys. L-glutamové Kyselina L-glutamová (symbol Glu nebo E) je kódovaná glukogenní neesenciální aminokyselina. V potravinářství se označuje kódem E 620. Její soli se nazývají glutamany (glutamáty). Jsou to ochucovadla (,,Látky chuťové a povzbuzující") přidávaná do celé řady potravin (jako koření). Při požívání ve větším množství jsou škodlivá, neměla by se vůbec dávat kojencům a dětem do 3 let. Vzhledem k přítomnosti dvou karboxylových skupin v molekule vykazuje kyselina Lglutamová slabě kyselou reakci; proto se řadí ke kyselým aminokyselinám spolu s kyselinou L-asparagovou. Protože má v molekule jedno chirální centrum, uhlíkový atom, k němuž je připojena karboxylová a aminová skupina, existuje kyselina glutamová ve dvou stereoizomerech, jako kyselina L-glutamová a kyselina D-glutamová, které mají stejné fyzikální vlastnosti s výjimkou optické aktivity. V živých organismech se však vyskytuje pouze L-forma. Její barnatá a zinečnatá sůl jsou špatně rozpustné ve vodě, čehož se využívá k jejímu dělení od směsi jiných aminokyselin. IZOTACHOFORÉZA Úvod Izotachoforéza patří mezi elektromigrační separační metody, které využívající rozdílné pohyblivosti iontů v elektrickém poli. Od ostatních elektromigračních metod se liší tím, že vzorek je dávkován mezi dva elektrolyty - vedoucí (leading L) a koncový (terminating T). Pro jejich výběr platí: Během jedné analýzy mohou být separovány pouze ionty jednoho znaménka, buď anionty nebo kationty. Izotachoforetický proces začne probíhat po připojení systému k elektrickému poli. Hodnoty konstantního proudu se pohybují v řádu desítek A. Proces analýzy můžeme rozdělit na dvě části. Nejprve dochází k oddělení složek vzorku, přičemž jednotlivé částice migrují ve směsné zóně různými rychlostmi. V druhé části, kterou můžeme považovat za ustálený stav se částice rozdělí a všechny se pohybují stejnou rychlostí. Obr.1 Dynamika separace směsi složek A a B, pro které platí je ukázána na obr.1. Během separace se rychlejší částice dostávají dopředu a pomalejší se zpožďují. Po ustálení vzniká stacionární stav, ve kterém jsou již zóny poskládány podle pohyblivosti svých částic. Mezi zónami vzniklo ostré rozhraní a dále se pohybují všechny stejnou rychlostí (koncentrace iontů v každé zóně je konstantní). Ostré rozhraní mezi jednotlivými zónami ve stacionárním stavu se popisuje pomocí tzv. samozaostřovacího efektu. Všechny ionty, ať pohyblivější nebo ty méně pohyblivé se pohybují stejnou rychlostí. Je to způsobeno rozdílným potenciálovým spádem v každé ze zón. Tento potenciálový spád je tím vyšší, čím méně pohyblivé ionty se v zóně nacházejí. To znamená, že na pomalejší ionty působí větší hnací síla. Analýza kyseliny glutamové Kvantitativní stanovení kyseliny glutamové se provádí pomocí kapilárního elektroforetického analyzátoru EA 100. V horní koloně systému dochází k předseparaci vzorku a v koloně spodní, separační, probíhá vlastní rozdělení a konduktometrická a podle zájmu i UV detekce složek vzorku. ÚKOL 1. Změřit kalibrační křivku (každý bod měřen 1x) 2. Změřit neznámý vzorek kyseliny glutamové (měřit 2 ­ 3x) 3. Identifikovat zónu kyseliny glutamové a kvantifikovat POSTUP 1) Příprava vedoucího a koncového elektrolytu Vedoucí elektrolyt: vypočítáme navážky 210-2 M histidinu a 210-2 M histidinchloridu do 250 ml, rozpustíme je v kádince asi ve 200ml vody a pak přidáme 50 ml 1% HEC (hydroxyethyl-celulóza) a doplníme do 250 ml odměrné baňky. Koncový elektrolyt (510-3 M kyselina morfolinethansulfonová ­ MES): připravíme do 250ml odměrné baňky rozpuštěním předem vypočítaného množství MES v destilované vodě. pH neupravujeme, je adjustováno protiiontem z vedoucího elektrolytu. 2) Příprava kalibračních roztoků K přípravě kalibračních roztoků použijeme zásobní roztok 10mM kyseliny glutamové. Z tohoto roztoku připravíme 0mM; 0,2mM; 0,4mM; 0,6mM; 0,8mM; 1mM roztoky kyseliny glutamové, které použijeme pro naměření kalibrační křivky. 3) Vlastní měření Podle přiloženého návodu připravíme přístroj k měření. Zvolíme optimální metodu (v našem případě metodu určí vyučující) a pomocí programu ITPWin provedeme analýzu. Získané výsledky graficky zpracujeme a spočítáme množství kyseliny glutamové v neznámém vzorku. Návod k obsluze kapilárního elektroforetického analyzátoru EA 100 1. Příprava přístroje Před začátkem práce je nutné celý systém promýt destilovanou vodou: a) destilovanou vodou naplníme rezervoáry TE, CE 1 a CE 2 b) injekční stříkačku s destilovanou vodou vložíme do otvoru IN column 2, otevřeme kohout 2 a mírným přerušovaným stlačováním injekční stříkačky proplachujeme spodní kolonu. Během tohoto proplachování musí být kohout 1 uzavřený a dávkovací kohout je v poloze A. Průtok kontrolujeme tak, že voda nám hadičkou proudí do odpadu. Injekční stříkačku po proplachu nevyndáváme a pod tlakem pomalu kohout 2 uzavřeme. c) druhou injekční stříkačku též s destilovanou vodou umístíme do otvoru IN column 1, otevřeme kohout 1 a opět mírným přerušovaným stlačováním propláchneme horní kolonu. Zkontrolujeme, zda máme dávkovací kohout stále v poloze 1 a kohout 2 musí zůstat samozřejmě zavřený. Pod tlakem kohout 1 uzavřeme. Obě kolony jsou nyní naplněny vodou. !! Rezervoáry jsou od kolony odděleny pomocí tenkých membrán, příliš velký tlak při plnění by mohl způsobit jejich protržení, proto opatně a jemně !! d) propláchnutí dávkovacího kohoutu provedeme tak, že při naplněném rezervoáru TE otočíme dávkovací kohout do polohy B a sledujeme, zda voda odtéká do odpadu. V případě, že neodtéká, rezervoár uzavřeme a pomocí prázdné injekční stříkačky vytvoříme mírný přetlak. e) nyní, když máme celou kolonu propláchnutou destilovanou vodu, odsajeme ji z rezervoárů CE 1 a CE 2 pomocí prázdné injekční stříkačky se zúženým nástavcem. Z kolony ji odstraníme tak, že vyndáme obě stříkačky s destilovanou vodou ze střední části kolony, vyprázdníme je a vložíme je zpět na původní místa ,, naplněné vzduchem" (kohouty 1 a 2 jsou uzavřené). Dávkovací kohout máme opět v poloze A a při mírném přerušovaném stlačování injekční stříkačky v otvoru IN column 2 pomalu odstraňujeme destilovanou vodu ze spodní kolony (kohout 1 je uzavřený). Voda nám proudí do odpadu. Kohout 2 uzavřeme a za otevřeného kohoutu 1 uděláme totéž i s horní kolonou a injekční stříkačkou vloženou do otvoru IN column 1. Rezervoár TE vyprázdníme pootočením dávkovacího kohout do polohy B (zároveň tím kohout promyjeme). Zásobník na koncový elektrolyt TE Kohout Spodní Horní Kohout Zásobník na vedoucí elektrolyt CE 1 Zásobník na vedoucí elektrolyt CE 2 2. Plnění a příprava na analýzu a) koncovým elektrolytem naplníme horní rezervoár TE tak, aby byla ponořena elektroda (dávkovací kohout je v poloze A). Pootočením do polohy B necháme malé množství odtéct do odpadu, kvůli eliminaci možných vzduchových bublin (neteče-li použijeme přetlak) a kohout vrátíme do polohy A. b) rezervoáry CE 1, CE 2 naplníme vedoucím elektrolytem, dáváme pozor aby se nevytvořili bublinky. c) jednu injekční stříkačku naplníme dostatečným množstvím vedoucího elektrolytu a umístíme do otvoru IN column 2. Stejně jako při proplachování kolonu naplníme (kohout 1 je zavřený) a pod tlakem kohout 2 uzavřeme. Musíme zkontrolovat, zda nám v kapiláře ve spodní koloně nezůstaly žádné vzduchové bublinky. Znemožnily by sepnutí elektrického obvodu. Injekční stříkačku po celou dobu práce nevyndáváme. V případě vzniku bublinek je buď pulzně odstraníme nebo v nejhorším případě znovu ,,promyjeme vzduchem" a opět naplníme elektrolytem. d) do otvoru IN column 1 dáme druhou injekční stříkačku naplněnou vedoucím elektrolytem, kohout 1 otevřeme a pomalu plníme. Po naplnění kohout opět pod tlakem uzavřeme. Máme-li v systému bublinky, postupujeme stejně jako v předchozím bodu. Pomocí krytů všechny rezervoáry zašroubujeme. IN column 1 IN column 2 !! Pozor na vzduchové bubliny!! Polohy dávkovacího kohoutu Pracovní poloha dávkovacího kohoutu (poloha C) po nadávkování vzorku a koncového elektrolytu. Dávkování vzorku, vzorek se dávkuje s kohoutem 3. Příprava řídícího počítače a injektáž vzorku a) zkontrolujeme připojení jednotky EA 100 a řídícího počítače do sítě. Na izotachoforetickém přístroji zapneme spínač umístěný vzadu vlevo dole. Naskočí displej vodivosti. b) zapneme řídící počítač, není-li zapnut a spustíme program ITPWin umístěný na ploše počítače. Otevře se nám okénko Main ITPWin Window, kde zvolíme MEASURE. c) naskočí nám měřící okno, kde v horní nabídce vybereme METHOD a zvolíme požadovanou metodu. V našem případě je to metoda GLUTAMAT d) připravený vzorek nasajeme do injekční stříkačky a vsuneme do otvoru v horní části separační jednotky (vede do dávkovacího kohoutu). Dávkovací kohout máme v poloze A a malé množství vzorku prostříkneme do odpadu. Nyní máme naplněn objem 30l. Dávkovací kohout pootočíme do polohy B a sledujeme zda v zásobníku TE ubývá elektrolyt, po pár mm přepneme do polohy C. Teď je systém připraven pro analýzu. e) dávkovací kohout máme tedy v pracovní poloze a zavřeme dvířka přístroje. Spustíme analýzu příkazem START. Rozsvítí se červená kontrolka HIGH VOLTAGE signalizující zapnuté napětí. !! Zásadně neotvírejte dvířka při probíhající analýze (při svítící kontrolce HIGH VOLTAGE)!! pozn. V případě, že se v systému vyskytují bublinky se analýza nerozběhne a počítač nás upozorní, je třeba systém opětovně propláchnout vedoucím elektrolytem a znovu nadávkovat vzorek. !! Po doběhnutí analýzy otevřeme dvířka a dávkovací kohout musíme vrátit do polohy A!! f) v prvním kroku probíhá předseparace v horní koloně (Upper), na obrazovce se objeví postupující čas, velikost proudu a velikost napětí. Zároveň se zaznamenává konduktometrická křivka detektorem umístěným na horní koloně g) po přepnutí na dolní kolonu (Lower) se objeví podobný panel s odlišnými parametry, po skončení analýzy se program automaticky zastaví a zeptá se na uložení. Dávkovací kohout otočíme zpět do polohy A a připravíme pro další analýzu. Naměřená data tedy uložíme a později zpracujeme. 4. Příprava opakované analýzy a) dávkovací kohout máme v poloze A, obě kolony propláchneme stejným způsobem jako při naplnění kolony. Na propláchnutí kolony stačí přibližně 2 ml vedoucího elektrolytu z injekčních stříkaček. Nadávkujeme vzorek, pootočíme dávkovací kohout do polohy B, necháme odtéct trochu koncového elektrolytu a otočíme do pracovní polohy C. V horním panelu spustíme Start. !! Před každým dávkováním vzorku injekční stříkačku propláchneme destilovanou vodou, kontrolujeme zda se nám do kolony nedostali bublinky!! 5. Ukončení analýzy a) po naměření poslední analýzy vypneme spínač na zadní straně b) roztoky z rezervoárů odsajeme a z kolony jej pod tlakem prázdnými injekčními stříkačkami vytlačíme do odpadu, poté promyjeme destilovanou vodou stejně jako v předchozích případech. c) všechny použité injekční stříkačky propláchneme destilovanou vodou a uložíme. Odpad z nádobky vylejeme a pomocí krytů zašroubujeme všechny rezervoáry. pozn. Celý systém zůstane naplněný destilovanou vodou 6. Vyhodnocení výsledků a) v hlavní nabídce otevřeme okno LOWER detektor a vybereme naměřený soubor. b) po zobrazení grafu označíme ve spodní nabídce IdealGr (grafem se proloží ideální tvar a číselným označením píků). V horní nabídce ANALYZE zvolíme ZoneTable a zobrazí se nám tabulka s čísly píků, pro pík odpovídající kyselině glutamové odečteme délku (Lenght). c) do grafu vynášíme délku píku v závislosti na koncentraci kyseliny glutamové. Množství neznámého vzorku získáme pomocí kalibrační přímky z rovnice regrese.