Chromatografické metody

                                              Podstata



                                    "Při chromatografii dochází

                                       k neustálému vytváření

                                    rovnovážných stavů separované

                                 látky mezi dvě fáze -- stacionární a

                                             mobilní."

                                           Chromatografie

*      Mobilní fáze - kapalina -- LC

                            plyn -- GC



*      Eluce - Izokratická -- stejná eluční síla

                Gradientová -- rostoucí eluční síla



*      Použití - analytická

                  preparativní

                                     Kapalinová chromatografie
                                                LC|





*      Mobilní fáze               -      kapalina



*      Stacionární fáze      -      pevná fáze, 

                                             kapalina

                                            Provedení LC



*      Papírová PC



*      Tenkovrstvá TLC



*      Kolonová CC

                                 Teoretické aspekty chromatografie

                                           Chromatografie

                                            Chromatogram

                                     Retenční -- eluční čas t[r

]*      Doba od nástřiku vzorku po dosažení maxima eluční křuvky

                                            Mrtvý objem

                                        Kapacitní faktor k'

                                          Účinnost kolony
                                     počet teoretických pater N

                                          Účinnost kolony
                              výškový ekvivalent teoretického patra H

                                          Účinnost kolony

                                             Rozlišení

                                      Síly a efekty využívané
                                            při separaci

*      Iontové síly

*      Polární síly

*      Nepolární síly

*      Sterické interakce

*      Efekt velikosti molekul

                                     Rozdělovací chromatografie

                                     Rozdělovací chromatografie

                                      Adsorpční chromatografie

                                      Adsorpční chromatografie

                                      Adsorpční chromatografie

*      Stacionární fáze -- polární



   Silikagel SiO[2] . n H[2]O



   Oxid hlinitý Al[2]O[3], AlO(OH), Al(OH)[3



]   Hydroxyapatit [Ca[5](PO[4])[3]OH]



                                      Adsorpční chromatografie

*      Mobilní fáze -- nepolární



*      Eluce - zvyšováním polarity mobilní fáze



                                         Eluotropická řada:

                                uhlovodíky<subst.uhlovodíky<ketony<

                                       aldehydy<alkoholy<voda

                                   Reverzně fázová chromatografie

*      Stacionární fáze -- nepolární

                                 C[8],  C[18

]

*      Mobilní fáze -- polární -- vodné roztoky

                                             pH  (r) potlačit disociaci



*      Eluce -- snižováním polarity mobilní fáze

                ACN, MetOH,



                                   Reverzně fázová chromatografie

                                   Iontově párová chromatografie

                                   Iontově párová chromatografie

                                     Hydrofobní chromatografie

[*      ] Stacionární fáze -- - C[8],  -fenyl



*      Mobilní fáze -- vodné roztoky

                            1.7 M (NH[4])[2]SO[4]

                                            

*      Eluce -- snižováním iontové síly



Použití : purifikace bílkovin



                                      Ionexová chromatografie

                                      Ionexová chromatografie

                                               Ionexy

*      Katexy - - vazba kationtů

silné - sulfo(S), sulfopropyl(SP) OSO[3]^-

slabé - karboxy(C), karboxymetyl(CM) COO^-



*      Anexy - + vazba aniontů

silné - dietylaminoetyl(DEAE)

slabé -- trietylaminoetyl(TEAE)



                                            Slabý ionex

*      Vykazuje změny vazebné kapacity v závislosti na pH

*      Má pufrační kapacitu

                                      Ionexová chromatografie

                                           Donanův efekt

                                      Ionexová chromatografie

*      Nanášení vzorku -- nízká iontová síla



*      Eluce -- gradientová

    *   Zvyšováním iontové síly

    *   Změnou pH

    *   Afinitní eluce

Použití -- purifikace, zakoncentrování, výměna

               pufru

                                          Chromatofokusace
                                           děj na koloně

                                          Chromatofokusace
                                           chování vzorku

                                          Chromatofokusace
                                           chování vzorku

                                      Afinitní chromatografie

                                         Afinitní interakce

                                 Interakce mezi DNA a endonukleasou

                                           Afinitní páry

                                      Afinitní chromatografie
                                          nanesení vzorku

                                      Afinitní chromatografie
                                          vznik interakce

                                      Afinitní chromatografie
                                           vymytí balastů

                                      Afinitní chromatografie
                                               eluce

                                   Předpoklady pro vznik komplexu

*      Sterické -- použití raménka (spacer)









*      Optimální pH, iontová síla

                                   Předpoklady pro vznik komplexu

*      Vazebné



*      Konformační



                                             Provedení

*      Nanesení vzorku -- nízká iontová síla



*      Eluce -- selektivní - volným ligandem

              -- neselektivní - změna pH, iontové     

                                       síly, polarity



Použítí : analytické (stanoveni K), purifikace

                                  Gelová permeační chromatografie

                                  Gelová permeační chromatografie

                                  Gelová permeační chromatografie

                                  Gelová permeační chromatografie

                                  Gelová permeační chromatografie

*      Nanášení vzorku -- objem vzorku < 2%

                                  objemu kolony

*      Eluce -- izokratická



Použití : stanovení Mr, odsolování, purifikace

                                              PC a TLC

                                              PC a TLC

*      1944 -- Martin, Snyge - PC aminokyselin

                                         (Nobelova cena)



*      1952 -- TLC nahrazuje PC

                                       Instrumentace PC a TLC

                                       Chromatografický papír

*      Nemodifikovaný



*      Modifikovaný -- ionexy, acylace



f. Watman (Anglie)

   Schleicher-Schüll (Německo)

                                                TLC

*      Vlastní příprava - sypané, nalévané



*      Komerčně dostupné - Siluful (Cz)

                                       Watman



                                          PC a TLC - mody

*      rozdělovací

*      adsorpční

*      ionexová

*      hydrofobní -- RP a HIC

*      gelová permeační

                                          Nanášení vzorku

*      Pipety



*      Kapiláry



                                             Provedení

*      Vzestupné



*      Sestupné



*      Kruhové



*      Dvojrozměrné



                                             Vzestupné

                                              Sestupné

                                              Kruhové

                                              Vyvíjení

                                            Dvojrozměrné

                                             Provedení

*      Analytické



*      Preparativní



                                        Analýza kvalitativní

                                       Analýza kvantitativní





*      Planimetrie



*      Denzitometrie

                                           Denzitometrie

                                           Denzitometrie

                                             Preparace

*      PC -- vystřižení a eluce skvrny



*      TLC -- vyškrábání a eluce skvrny

            -- odsání a eluce skvrny

                                           Chromatografie

                                           Chromatografie

                                     Kapalinová chromatografie
                                             rozdělení

*      Nízkotlaká (atmosferický tlak) -- LPC



*      Střednětlaká (4 Mpa) -- FPLC



*      Vysokotlaká (40 Mpa) -- HPLC

                                     Kapalinová chromatografie
                                              využití

*      LPC -- semipreparativní



*      FPLC -- semipreparativní a analytická



*      HPLC -- analytická



                                     Kapalinová chromatografie
                                            doba trvání

*      LPC -- hodiny



*      FPLC -- desítky minut



*      HPLC -- minuty

                                          Zařízení pro LPC

                                       Instrumentace pro LPC

*      Pumpa -- peristaltická nebo gravitace

*      Gradient -- mísič gradientu

*      Dávkování -- přímo pumpou na kolonu

*      Kolony -- skleněné

*      Detekce -- spektrofotometrická 254, 280 nm

*      Vyhodnocování -- zapisovač

*      Sběrač frakcí -- programovatelný

                                   Instrumentace pro FPLC a HPLC

                                         Zařízení pro HPLC

                                               Pumpy

                                           Tlaková pumpa

                                         Lineární dávkovače

                                         Pumpa jednopístová

                                         Pumpa dvoupístová

                                         Pumpa dvoupístová

                                         Pumpa dvoupístová

                                           Tlumení pulsů

                                           Tlumení pulsů

                                        Gradient nízkotlaký

                                        Gradient vysokotlaký

                                    Dávkování -- dávkovací ventil

                                     Dávkovací ventil -- "Load"

                                    Dávkovací ventil -- "Inject"

                                               Kolona

                                          Částice sorbentu

                                             Detektory

                                     Refraktometrický detektor

                                     Refraktometrický detektor

                                     Refraktometrický detektor

                                         UV -- VIS detektor
                                           detekční cela

                                         UV -- VIS detektor
                                       s fixní vlnovou délkou

                                         UV -- VIS detektor
                                    s proměnlivou vlnovou délkou

                                         UV -- VIS detektor
                                          s diodovým polem

                                       Fluorescenční detektor

                                      Elektrochemický detektor

                                     Konduktometrický detektor

                                               LC-MS

                                            "Termospray"

                                           "Electrospray"

                                              Ionizace

                                            Derivatizace

*      "pre-column" - před vlastní analýzou



*      "post-column" -- za kolonou po analýze

                                       Šum a drift detektoru











Mez detekce S/N > 2-3

Mez stanovitelnosti S/N > 10



                                            Vyhodnocení

*      Zapisovače



*      Integratory



*      Integrační software + PC

                                             Provedení

*      Analytické



*      Preparativní



                                        Analýza kvalitativní

*      Srovnání retenčních časů (objemů) píků u vzorku a standardů

*      "spiking" -- přidání standardu do vzoru (r)

                       nárůst výšky píků

*      Specifická detekce -- UV-VIS, fluorescence,

                                     elektrochemická

*      MS

                                       Analýza kvantitativní

                                                 -

                                        Plocha (výška) píku



                                 *      Metoda externího standardu

                                 *      Metoda vnitřního standardu

                                *      Metoda standardního přídavku



                                             LC analýza