snímek 1 Metody separace proteinů ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 2 Literatura ˇ Anzenbacher, Kovář : Metody chemického výzkumu pro biochemiky ˇ Ferenčík : Biochemická laboratorní technika ˇ Scopes : Protein Purification ˇ Harris : Protein Purification Methods ­ Practical Approach ˇ Deutcher : Guide to Protein Purification ˇ Janson : Protein Purification ˇ Kastner : Protein Liqiud Chromatography ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 3 Metody separace proteinů ˇ Vychází z klasických metod chemické analýzy ˇ Uplatňují se zde i speciální metody ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 4 Separace kvalitativní ˇ Analytické kvantitativní ˇ Preparativní Charakterizace ­ pI, MW, spektra, AMK .... ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 5 Problémy se vzorkem ˇ Komplexnost ˇ Malá množství ˇ Labilita ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 6 Zásady pro práci s biologickým materiálem 1. Teplota 2. pH + iontová síla 3. Koncentrace bílkoviny 4. Pěnění 5. Lokální přebytky 6. Proteázy ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 7 Plánování separace bílkovin ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 8 Cíl izolace ˇ Získání homogenní bílkoviny ˇ Zachování biologické aktivity ˇ Čistota Závěr : získat vzorek o patřičné čistotě s vynaložením patřičného úsilí ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 9 Volba vstupního materiálu ˇ Preparát z daného organismu ˇ Preparát s největším obsahem dané bílkoviny ˇ Preparát s nejmenším obsahem nečistot ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 10 Volba a kombinace separačních metod ˇ Rozlišovací schopnost ˇ Selektivita ˇ Kapacita ˇ Zpětný výtěžek ˇ Náklady ­ materiál, přístroje, člověk ˇ Stupeň zřeďování a koncentrace ˇ Slučitelnost mezi metodami ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 11 Základní zásady ˇ Na začátek zařadit metody s vysokou kapacitou a malým výtěžkem a rozlišením velké množství levného vstupního materiálu ˇ Později metody s vysokým rozlišením a výtěžkem, kapacita méně významná ve vzorku již investovaná práce ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 12 ˇ Pořadí volit tak, aby metody na sebe vhodně navazovaly ˇ Metody zřeďovací kombinovat s metodami koncentrujícími ˇ Metody nepoužívat opakovaně ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 13 Sledování průběhu separace 99 %1.991.999950HIC 75 %1.537525IEX 100 %-1100100extrakt VýtěžekPřečištěníSpecifická aktivita Celková aktivita Celková bílkovina Metoda ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 14 Stanovení koncentrace bílkoviny na stanovení koncetrace dusíku na základě optických vlastností na základě elektrochemických vlastností Metoda založená ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 15 Kjeldahlova metoda ­ stanovení N2 ˇ Mineralizace vzorku ­ převedení organického dusíku na NH4 + ˇ Stanovení NH4 + - titrace, fotometrie, selektivní elektrody ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 16 UV spektrofotometrie ˇ 280 nm ­ aromatické AMK interference nukleotidů ˇ 180 - 230 nm ­ peptidická vazba Výhody - nedestruktivní metoda - není třeba kalibrace ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 17 VIS spektrofotometrie Přídavek činidla barevný derivát ˇ Destruktivní metoda ˇ Nutná kalibrační závislost ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 18 Biuretová metoda Princip : Cu2+ vytváří v alkalickém prostředí komplex se 4 N peptidické vazby Cu2+ Měření : 540 ­ 560 nm 310 nm ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 19 Folinova metoda Princip : hydroxyfenolová skupina tyrosinu redukuje fosfomolybdenany na molybdenovou modř Měření : 725 nm ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 20 Lowryho metoda Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody Měření : 600 nm ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 21 Metoda dle Bradfordové Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. Meření : 595 nm ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 22 Fluorescence Princip : - vazba fluoroforu na bílkovinu měření vzniklé fluorescence - zhášení fluorescence přídavkem bílkoviny ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 23 Polarografie Princip : Brdičkova reakce ­ SH skupiny bílkoviny vstupují v přítomnosti Co2+ katalytické reakce na Hg elektrodě proud ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 24 Nejčastěji používané metody sorpce barviva0.01 - 0.05Bradfordové interference0.01 - 0.05UV ­ 205 nm interference0.05 - 2UV - 280 nm pomalý vývoj0.05 - 0.5Lowryho okamžitý vývoj0.5 - 5Biuretová PoznámkaRozsah (ng)Metoda ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 25 Stanovení biologické aktivity Enzymatické,imunologické, toxické, hormonální receptorové atd.. ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 26 Vlastní separace ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 27 Obecné schéma Získání vstupního materiálu Rozrušení buněk Separace ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 28 Vstupní materiál ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 29 Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy Výhody - lze jej snadno získat v dostatečné množství - selekce mutantů o požadovaných vlastnostech - genetické inženýrství - termofilní organismy ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 30 Bezobratlí Hmyz, plži, mlži Nevýhody - málo se používá, nesnadno se získává ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 31 Živočišné tkáně ˇ Laboratorní zvířata ­ myši, krysy, králíci ˇ Jateční zvířata ­ orgány ˇ Člověk ­ tělní tekutiny ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 32 Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách Nevýhoda ­ problematický růst za definovaných podmínek ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 33 Manipulace s biologickým materiálem ˇ Pokud možno zpracovat co nejdříve ˇ Zmražení ­ při ­ 60 ­ 80 oC ˇ Rozmrazování ­ co nejrychleji ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 34 Rozbití a extrakce ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 35 Bakterie ˇ Záleží na lokalizaci cytoplasma periplasma ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 36 Balotina Princip ­ jemné skleněné kuličky přidány do bakteriální suspenze a rychle třepány nebo míchámy ­ nutno chladit ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 37 French (X) press Princip ­ zmražená bakteriální suspenze protlačována malým otvorem, přičemž dochází k rekrystalizaci a rozrušení buněk ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 38 Ultrazvuk Princip ­ ultrazvuk (> 20 kHz) v roztoku vyvolává střižní síly ­ nutno chladit ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 39 Lysozym + osmotický šok (mírný osmotický šok) Princip ­ lysozym rozruší buněčnou stěnu, následně je bakteriální suspenze zředěna destilovanou H2O ­ bakterie popraskají ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 40 Další ˇ Alumina Al2O3 ­ roztírání v třecí misce ˇ Opakované zmražování a rozmražování ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 41 Kvasinky Toluenová autolýza Princip ­ toluen extrahuje při 35 ­40 oC fosfolipidy buněčné stěny osmotický šok enzymová autolýza Balotina, French press, ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 42 Živočišné tkáně ˇ Třecí miska s pískem ˇ Ruční homogenizatory ­ Potter ­ Elvehjemův ˇ Mixery ˇ Osmotická lyse - erytrocyty ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 43 Rostlinné tkáně ˇ Rozrušení buněčné stěny pomocí celulas, ˇ Obsahují hodně fenolických látek, které mohou být oxidovány na chinony ­ melaniny, které mohou modifikovat bílkoviny ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 44 Optimalizace extrakce ˇ Teplota ­ 4 ­ 6 oC chlazení ˇ pH ­ optimální pro danou bílkovinu ­ práce v pufrech ˇ I ­ v prostředí o definované iontové síle ˇ Přídavky látek ­ EDTA, -merkaptoethanol, kovové ionty, inhibitory proteáz ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 45 Separace subcelulárních organel 60´100 000 gRibozomy, fragmenty end.retikula a Gold.systém 30´30 000 gLysozomy, membrány 20´15 000 gMitochondrie, bakterie 10´4 000 gJádra, chloroplasty 5´1 000 gEukar.buňky ČasTíhové zrychleníOrganela ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 46 Enzymy - markery monoaminoxidasaMitochondrie out cytochromoxidasaMitochondrie in Kyselá fosfatasaLysozom katalasaPeroxisom galaktosyltransferasaGoldiho systém Glukosa-6-fosfatasaEndoplazmatické retikulum LDHCytoplasma EnzymOrganela ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 47 Membránově vázané bílkoviny elektrostaticky hydrofobně interagující zanořené transmembránové integrální Membránové bílkoviny ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 48 Izolace membránových bílkovin ˇ Chemicky ­ detergenty, chaotropní soli, organická rozpouštědla, nízká iontová síla, ˇ Fyzikálně - homogenizace, sonikace ˇ Enzymaticky ­ fosfolipasy, lipasy, proteasy ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 49 Centrifugace ˇ Odstranění hrubých částic z roztoku Sediment (pelet) ­ supernatant ˇ Izolace organel nebo biomakromolekul ˇ Stanovení základních parametrů ­ MW, hustota, sedimentační koeficient ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 50 Použití Preparativní Analytická Centrifugace ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 51 Otáčky g rad rg .2 = f.2 = - uhlová rychlost (rad/s) f ­ otáčky/min ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 52 Rozdělení centrifug Pomalootáčková 5 000 ot/min Rychlootáčková 25 000 ot/min Ultracentrifugace 80 000 ot/min Centrifugace ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 53 Preparativní centrifugace diferenciální dvě fáze (sediment supernatant) zonální zóny (gradient) Centrifugace ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 54 Metody nanášení vzorku frontální vzorek v celé kyvetě zonální vzorek - úzká zóna Metoda ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 55 Preparativní centrifuga ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 56 Preparativní centrifuga ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 57 Preparativní ultracentrifuga ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 58 Rotory ˇ Úhlový ­ diferenciální centrifugace ˇ Výkyvné ­ zonální centrifugace ˇ Zonální ­ bez kyvet, vzorek je uvnitř rotoru ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 59 Úhlový rotor ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 60 Výkyvný rotor ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 61 Gradientová centrifugace média ˇ Sacharosa ˇ Glycerol ˇ Ficoll - dextran ˇ Percoll ­ SiO2 ˇ CsCl ­ gradient vzniká během centrifugace Hypertonické prostředí Nutno připravit gradient ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 62 Gradientová centrifugace Izopyknická Nerovnovážná Metoda ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 63 Gradientová centrifugace ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 64 Zonální rotor ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 65 Centrifugace se zonálním rotorem ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 66 Analytická ultracentrifuga ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 67 Analytická ultracentrifuga ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 68 Kyveta ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 69 Analytická centrifugace ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 70 Analytická ultracentrifugace sedimentační rovnováhy sedimentační rychlosti Metoda ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 71 Metoda sedimentační rovnováhy x - vzdálenost A-absorbance ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 72 Metoda sedimentační rychlosti x - vzdálenost A-absorbance ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 73 Fázové separace ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 74 Odstranění H2O rotační vakuová odparka ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 75 Odstranění H2O lyofilizace Ňamražení ˇMrazová sublimace ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 76 Odstranění H2O zahuštění Použití semipermeabilní membrány Vzduch - pervaporace xerogely Látky s afinitou k H2O ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 77 Odstranění H2O zahuštění Použití semipermeabilní membrány ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 78 Odstranění H2O zahuštění Použití semipermeabilní membrány ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 79 Odstranění nízkomolekulárních složek Dialýza ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 80 Stanovení interakčním konstant Rovnovážná dialýza ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 81 Ultrafiltrace Použití speciálních membrán s definovanou velikosti pórů - tzv. cut-off limit ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 82 Ultrafiltrace míchané cely ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 83 Ultrafiltrace centrifugační přípravky ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 84 Ultrafiltrace Hollow fiber ­ dutá vlákna ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 85 Ultrafiltrace Hollow fiber ­ dutá vlákna ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 86 Příprava laboratorní vody ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 87 Nečistoty ve vodě ˇ Soli ­ těžké kovy - denaturace ˇ Organické látky ­ HPLC, GC ˇ Hrubší částice ­ mikroorganismy ˇ Koloidní částice - biomakromolekuly ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 88 Kriteria čistoty ˇ Vodivost ­ 18 M/cm ˇ Těžké kovy ­ AAS ˇ Pyrogenita ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 89 Postupy čistění destilace ˇ Destilace ­ teoreticky odstraní všechny složky, prakticky jsou strhávány těžké kovy z elektrod (Cu, Zn, Fe) ˇ Redestilace ­ křemenné aparatury Nevýhoda ­ náklady na vodu a elektrickou energii ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 90 Postupy čistění reverzní osmoza ˇ Nevýhoda ­ malá kapacita, nevyčistí úplně ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 91 Postupy čistění deionizace ˇ Kolony se směsnými ionexy ­ katex + anex ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 92 Postupy čistění elektrodeionizace ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 93 Postupy čistění odstraňování org. látek ˇ Speciální patrony s aktivním uhlím a jinými sorbenty ˇ UV ­ 180 nm + 254 nm - oxidace org. látek, - likvidace bakterií ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 94 Postupy čistění filtrace ˇ Membránová ­ vetší póry ­ bakterie ˇ Ultrafiltrace ­ malé póry - koloidní částice ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 95 Kaskádový systém kombinace ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ snímek 96 Kaskádový systém kombinace Millipore ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________ ___________________________________