Kapilární elektroforéza Stacking On-line zakoncentrování vzorku přímo v kapiláře, tzv „stacking“, hraje důležitou roli při stanovení velmi zředěných analytů. Během stacking procesu dochází k zakoncentrování vzorku, kdy nadávkovaná dlouhá zóna s nízkou koncentrací vzorku je fokusována do zóny krátké o koncentraci podstatně vyšší. Pak následuje separace individuálních zón a jejich detekce. Stacking proces může být založen na různých principech, v tomto cvičení se seznámíme se základním principem, kde v každém bodě kapiláry platí Kohlrauschova regulační funkce S c[i]/m[i] = konst. kde c[i ]je analytická koncentrace a m[i] iontová mobilita komponenty i . Po nástřiku dlouhé zředěné zóny o nízké koncentraci vzorku a tudíž o nízké vodivosti dané zóny a vložení separačního napětí na kapiláru, je intenzita elektrického pole na této zóně mnohem vyšší než na zbytku kapiláry. Tam je vodivost dána složením základního elektrolytu (BGE) a je podstatně vyšší. Vlivem vyšší intenzity elektrického pole nadávkované zóny migrují ionty analytu rychleji, než by migrovaly v základním elektrolytu až k rozhraní analyt-základní elektrolyt, kde jsou po průchodu rozhraním vlivem nižší intenzity el. pole v BGE zpomaleny a zakoncentrovány v úzkou zónu a dále migrují a separují se dle principů klasické zónové elektroforézy. Tento proces budeme sledovat a) na počítači pomocí simulačního programu Simul 5 b) při analýze na komerčním přístroji BioFocus 3000 fy BioRad A) Simulace pomocí programu Simul 5 Simulační program SIMUL 5 (prof. Gaš, www.natur.cuni.cz/gas) umožňuje sledování koncentračního profilu každé ze složek zvoleného elektrolytového systému (BGE i vzorek), pH a vodivosti v každém bodě migrační dráhy v závislosti na čase. Na základě toho lze předpovědět průběh reálné analýzy a zvolit její optimální podmínky. 1. Seznámení s programem, parametry důležité pro výpočty – iontová mobilita, disociační konstanta, koncentrace, délka kapiláry, délka nástřiku, separační napětí 2. Simulace pro systém : vzorek – kyselina benzoová + kyselina salicylová BGE – 0.05M kyslina octová + Na^+ , pH=5 Úkol : popište a srovnejte průběh některých z provedených simulací a přiložte vybrané záznamy B) Analýza směsi kyseliny benzoové a pikrové Podmínky : měření budou prováděna na komerčním přístroji BioFocus 3000 fy BioRad s absorbančním detektorem umožňujícím práci s jednou vlnovou délkou nebo snímat současně celé spektrum v rozmezí 190-300nm. Separační křemenná kapilára ( celková délka 24.6cm, 20cm k detektoru, vnitřní průměr 75 mm) je umístěna v termostatované kartridži a její vnitřní povrch je modifikován vrstvičkou polyakrylamidu pro eliminaci elektroosmózy. Vzorek bude dávkován tlakem. BGE – 0.05M kyslina octová + Na^+ , pH=5 Úkol 1) Podle spekter vyberte nejvhodnější vlnovou délku pro analýzu 2) Ze zásobního roztoku připravte vzorky směsí kyselina benzoová + kyselina salicylová o konc. 10^-4, 10^-5, 10^-6 M 3) Provedťe analýzy a optimalizujte dobu nástřiku a separační napětí 4) Vypočítejte separační účinnost kapiláry pro vybrané měření vyjádřenou v počtu teoretických pater N = 5.54 (t/w[1/2])^2 kde t = doba migrace, w[1/2] je šířka píku v polovině jeho výšky 5) K protokolu přiložte popsané elektroferogramy