Exprimované geny a přírodní selekce Produkty funkčních genů a jejich význam v ekologických studiích Evoluční ekologie •studuje selekční tlaky dané prostředím a evoluční odpovědi na ně ® vznik adaptací, tj. geneticky podmíněné přizpůsobení se prostředí • •interakce s abiotickým prostředím Adaptace ve vztahu k jiným jedincům •pohlavní výběr (vnitrodruhové interakce) • • • •predátor-kořist (mezidruhové interakce) • • •hostitel-parazit (mezidruhové interakce) Proč geny v molekulární ekologii? •Geny mají funkční význam – geneticky determinovaný polymorfismus •-> studium proximátních mechanismů • •Př.: Proč je samec hýla rudého červeně zbarven? •Evoluční ekologie (ultimátní vysvětlení) – aby se líbil samicím a zplodil s nimi více potomků •Molekulární ekologie (proximátní vysvětlení) – protože karotenoidy získané z potravy ukládá více do peří a méně je používá v imunitní odpovědi Expressed DNA segments - genes •strict nucleotide structure •exons and introns, START and STOP codons etc. •transcription + translation ® phenotype •oligogenes – qualitative traits (f.e. homeotic genes, Wnt ligands) • • Metody studia funkční variability 1.Sledování kandidátních genů 2. 2. 2.Genomické přístupy (mnoho genů najednou) pytlouš Chaetodipus intermedius Hoekstra, Nachman et al. •Tmavé a světlé zbarvení •Odpovídá barvě prostředí (tmavé zbarvení na lávě) •Arizona • •Korelace zbarvení s prostředím i na malé škále • •mtDNA nekoreluje se zbarvením • •Sekvenování kandidátních genů (známých z inbredních myší) • •melanocortin-1 receptor MC1R • •Záměna 4 aminokyselin • •Jednoduchá dědičnost alel a zbarvení • • • MC1R u člověka, mamuta a dalších •U člověka zrzavé vlasy a neschopnost se opálit •Zbarvení krav, koňů a psů •Výskyt dvou odlišných variant u mamutů MUPs Major Urinary Proteins - komplex velmi podobných genů • •Obtížně se studují (isoelektrická fokusace) • •Různé alely • •Navíc různá míra exprese • •→ individuální profil • •Čárový kód jedince Major histocompatibility complex (MHC) Pathogen Antigen-specifická imunitní odpověď Pathogen Antigen-specifická imunitní odpověď Pathogen Antigen-specifická imunitní odpověď Likvidace parazitů T buněčná cytotoxicita Pathogen Antigen-specifická imunitní odpověď Likvidace parazitů T buněčná cytotoxicita Pathogen Antigen-specifická imunitní odpověď Likvidace parazitů T buněčná cytotoxicita Protilátky Antigen-specifická imunitní odpověď Pathogen Likvidace parazitů T buněčná cytotoxicita Protilátky Evoluční ekologie: Kdo a jak rozpozná parazita ? Pathogen MHC VŠECHNY JADERNÉ BUŇKY (imunitní i neimunitní) MHC třídy I MHC třídy II ANTIGEN PREZENTUJÍCÍ BUŇKY (imunitní) Major histocompatibility complex (MHC) ch7_MHC-proteins Major histocompatibility complex (MHC) Class I Class II Oblast rozeznávající antigen Funkce MHC: rozeznání a prezentace cizorodého antigenu h_mhcPathway > Funkce MHC: rozeznání a prezentace cizorodého antigenu h_mhcPathway MHC Class I všechny buňky s jádrem MHC Class II makrofágy, dendritické buňky aj. Likvidace parazitů T buněčná cytotoxicita Protilátky Buňka nabízející antigen spustí imunitní odpověď Pathogen MHC Jak zjistit, že je gen pod selekcí? ch7_MHC-proteins Major histocompatibility complex (MHC) Class I Class II Oblast rozeznávající antigen (antigen-binding sites) Je variabilita MHC důsledkem přírodního výběru? Trans-species polymorfismus - výhodné alelické linie přetrvávají i po oddělení druhů Pozitivní selekce - vytvoření a udržení velkého množství funkčních variant Microtus Arvicola Clethrionomys Mus Rattus Kuličky Šikmá jemná mřížka Šikmá jemná mřížka Kuličky Šikmá jemná mřížka Šikmá jemná mřížka Kuličky Kuličky Kuličky Kuličky Kuličky Kuličky Šikmá jemná mřížka Šikmá jemná mřížka Šikmá jemná mřížka Šikmá jemná mřížka Šikmá jemná mřížka Šikmá jemná mřížka Šikmá jemná mřížka Šikmá jemná mřížka Šikmá jemná mřížka Šikmá jemná mřížka Kuličky Šikmá jemná mřížka Šikmá jemná mřížka MHC Class II, DQA gene, Exon 2 (Neighbour Joining Method) Fylogenetická analýza MHC sekvencí dN/dS •Poměr nesynonymních (dN) a synonymních (dS) mutací • •Alignment sekvencí stejného genu u více druhů → rozdíly (mutace) → jen některé mutace změní aminokyselinu – degenerovaný genetický kód • •Korekce (rozdílné metody, MEGA, PAML) jen 25 % možných záměn nezmění aminokyselinu některé typy mutací častější zpětné a konvergentní mutace (hlavně u více odlišných sekvencí) • •Většinou dN/dS << 1, selekce eliminuje změny, „purifying selection“ protein se nemění • •dN/dS >> 1 „positive selection“ - MHC • •Různé části proteinu mohou být pod různou selekcí Pozitivní historická selekce na MHC Class II 1)Poměr nesynonymních a synonymních mutací (dN/dS) na různých pozicích MHC molekuly dN/dS ABS Non ABS DRB 5.25 3.00 DQA 3.16 0.33 Šipky ukazují ABS místa identifikovaná na základě krystalografického modelu DQA proteinu u myši DQA 2)Detekce aminokyselin pod pozitivní selekcí – Bayesian modelling (CodeML) antigen-binding sites Důkaz a mechanismus recentní selekce •Srovnání populačně-genetické struktury na MHC genech a neutrálních znacích (mikrosatelity) • •Asociace MHC genů a výskytu parazitů •Srovnání populačně-genetické struktury na MHC genech a neutrálních znacích (mikrosatelity) neutrální znaky migrace náhodný drift MHC migrace náhodný drift neutrální znaky migrace náhodný drift MHC migrace náhodný drift selekce diverzifikující selekce MHC migrace náhodný drift selekce balancující selekce 1) Analýza populačně-genetické struktury Studované lokality – 7 populací ve stejné fázi populačního cyklu Canton Nozeroy (pohoří Jura, région Franche-Comté) 07 01 06 05 04 03 02 Bryja et al. 2007, Molecular Ecology Důkaz přírodního výběru v současnosti: analýza populačně-genetické struktury - Srovnání neutrálních znaků a MHC à 2001-2003: fáze růstu populační hustoty April 2002 October 2002 April 2003 October 2003 Diferenciace populací v průběhu růstu denzity Pokles diferenciace s nárůstem denzity (nárůst disperze, tj. toku genů) MHC (zejména DQA1) – signifikantně odlišné od mikrosatelitů * * * Signifikantní rozdíl DQA1 vs. mikrosatelity Bryja et al. 2007, Molecular Ecology Závěr: Typ selekce na MHC závisí na početnosti populace arvicola6 Nízká denzita Lokální rozdíly ve společenstvech patogenů Lokální diverzifikující selekce Vysoká denzita Nárůst diverzity parazitů v důsledku disperze Balancující selekce Bryja et al. 2007, Molecular Ecology Jaké jsou mechanismy přírodního výběru pro udržení vysoké variability MHC? •Hypotéza výhody heterozygotů – mají 2x více alel než homozygoti, tj. mohou rozeznávat 2x více patogenů • •Výhoda vzácné alely (= selekce negativně závislá na frekvenci) Výhoda heterozygotů - mají 2x více alel než homozygoti, tj. mohou rozeznávat 2x více patogenů •Dva druhy ryb – heterozygoti mají vyšší přežívání při umělém vystavení virům a helmintům •Nejednoznačné výsledky v mnoha dalších příkladech •Teoretické modely tuto hypotézu nepodporují ... •Člověk – rychlost vývoje onemocnění HIV nebo hepatitidy B je asociována s MHC heterozygotností • • Pravděpodobnost výskytu ptačí malárie roste s počtem MHC alel - vysoká variabilita = vysoká pravděpodobnost přežití akutní fáze Výhoda vzácné (výhodné) alely •Dynamická koevoluce mezi hostitelem a parazitem (= hypotéza „červené královny“) = selekce negativně závislá na frekvenci Výhoda vzácné (výhodné) alely Čas Čas „vzácná alela“ clostridium_tetani_1s Clostridium botullinum ch7_MHC-proteins ch7_MHC-proteins Výhoda vzácné (výhodné) alely Čas Čas •Zdá se být pravděpodobnější než „výhoda heterozygotů“ •Nutno prokázat, že skutečně dochází k časovým změnám ve frekvenci alel a parazitů – dlouhodobé studie neexistují !!! Asociace MHC genů a parazitů Gerbillurus paeba (Harf & Sommer, Mol. Ecol. 2005) gerbillurus vajíčka Nematoda v trusu černé – infikovaní bílé – neinfikovaní nematoda-vajicka Microcebus murinus (Schad et al., Evolution 2005) Apodemus flavicollis (Meyer-Lucht & Sommer, Mol. Ecol. 2005 ) • Velké množství testů, riziko "false positives" ® využití vícerozměrných metod Canton Nozeroy (pohoří Jura, région Franche-Comté) Př. Arvicola terrestris – hryzec vodní arvicola6 • 6 populací, 3 roky • téměř kompletní parazitologická analýza (včetně některých virů) • vícerozměrné analýzy Tollenaere, Bryja, et al., Journal of Evolutionary Biology (2008) 258px-Tenia_solium_scolex taenia_saginata_r poxvirus ekinokok Nematoda Frenkelia microti SSCP analýza ch7_MHC-proteins Analýza koinercie (co-inertia analysis) Alely DRB-11 a DRB-15 mají antagonistický efekt vzhledem k Trichuris arvicolae a k celkové diverzitě parazitů trichuris_vulpis-dospelec Tollenaere, Bryja, et al., Journal of Evolutionary Biology (2008) Výběr partnera a MHC •90. léta – experimenty s laboratorními kmeny myší vs. složení MHC • •pachové signály jsou využívány při rozeznávání příbuznosti a výběru partnera • •myši si vždy vybíraly partnera s odlišným MHC maze Yamazaki et al. 1976 Hypotézy pohlavního výběru podle MHC •A) Výběr partnera s odlišným MHC – „inbreeding avoidance hypothesis“ •MHC = „komplementární geny“ • • Ideál: Výběr partnera se specifickým genotypem zajišťujícím rezistenci Passerculus sm_atlantic_salmon_DC top1 moineau Hypotézy pohlavního výběru podle MHC •B) Výběr partnera, který nemá parazity (tj. není nemocný) •MHC = „dobré geny“, které lze „cítit“ • • Ideál: Výběr partnera se specifickým genotypem zajišťujícím rezistenci Hypotézy pohlavního výběru podle MHC •C) Výběr nejlepšího partnera, který nemá parazity, ale má ještě „něco navíc“ •MHC = „dobré geny“, umožňující expresi sekundárních pohlavních znaků • • bazant Ideál: Výběr partnera se specifickým genotypem zajišťujícím rezistenci Gallinago media Ekblom et al. 2005 Gasterosteus aculeatus Milinski et al. (2001-dosud) •Nedávno duplikované MHC class IIB geny •Nejvíce jedinců má střední počet alel •Střední počet alel = minimum parazitů • •♀♀ „počítají“ vlastní počet alel a vybírají si ♂♂ tak aby optimizovali počet alel u potomstva • •Výběr je ovlivněn strukturou komplexu MHC-peptid Počet MHC alel - ideální počet alel se liší v závislosti na prostředí (tj. diverzitě parazitů) „zlatá střední cesta“ Imunitní odpověď v mozku myši napadené "scrapie" (priony) •„Mapping and association studies have revealed that approximately half of the genetic variability for resistance to infection is attributable to non-MHC genes, suggesting that MHC-independent immune responses also undergo host–pathogen coevolution.“ Acevedo-Whitehouse & Cunningham 2006 Sledování mnoha genů najednou Genome Transcriptome Proteome DNA mRNA Proteins Transcription Translation Genomics Transcriptomics Proteomics GP_FA7TYN03040706_inv 3 billion bases 20-30,000 genes ~100,000 proteins Functional Genomics Budoucnost genetických metod v ekologickém výzkumu 1. Nové postupy při sekvenování DNA („genomics“) „genomics era“ 454 Solexa Budoucnost genetických metod v ekologickém výzkumu 2. Analysis of expression by microarrays („transcriptomics“) Ranz JM, Machado CA: Uncovering evoutionary patterns of gene expression using microarrays. TREE, 21(1): 29-37 Microarray analysis of transcriptome (~ specific DNA hybridization) Target (i.e. mix of transcripts in a form of cDNA = mRNA přepsaná do DNA reverzní transkriptázou, tj. neobsahuje introny) Probe (i.e. synthesized oligonucleotides complementary to particular genes) Sledování exprese genů microarrays •Sledování exprese mnoha (tisíce) genů najednou •Založeno na hybridizaci •Sleduje se rozdíl vůči kontrole ("heterologous hybridization") Transcriptional profiling of inbreeding depression and genetic erosion in Scabiosa columbaria: the balance between genetic drift and selection in the genetic erosion process. Scabiosa%20cretica%20(mariposa)_jpg Case study: Joop Ouborg et al. RU eng CMYK A4 cDNA library logo Ecogmomics 15k – 30k 60-mer microarrays 530.000 sequences in one run, leading to ~ 40.000 ESTs roots shoots inbred outbred small pop large pop scabiosa1 Scabiosa columbaria Experiment: transcriptional profiling of inbreeding depression Example: Annotation of these 40.000+ ESTs („expressed sequence tags“) Automated programs available, like BLAST2GO (http://www.blast2go.de/): just feed a file with the ESTs into the program, and turn it on…… 1 week later you will have the results, being: •Homology with known sequences •Known function The sequences may also be searched for: EST-associated SSR markers: MISA (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/) SNP markers: SNP-mining software like PolyBayes (http://genome.wustl.edu/tools/software/polybayes.cgi) Again by using search software, freeware ALMOST HALF OF GENES (ESTs) ARE UNKNOWN !!! logo Ecogmomics microarray5S 1. Design of quantitative RealTime-PCR methods, based on EST sequences 2. Design of a Scabiosa specific microarray QPCR samples microarray4 logo Ecogmomics Populus trichocarpa x deltoides a Malacosoma disstria bourovec Ralph et al. 2006 •cDNA microarray • •15496 genů > ¾ genomu • •Po 24 hodinách 1191 genů up-regulated 537 down-regulated • •Obrana: endochitinázy, inhibitory proteáz •Signální funkce • •Transport, metabolismus, regulace transkripce Jaká je úroveň exprese v různých tkáních? quantitative real-time PCR vliv aklimatizace k chladu (20° vs 15°C) - srdeční, červená a bílá svalovina - rozdíly v expresi 113, 81 a 196 genů - rozdíly jsou způsobeny tkáňově specifickým stupněm endotermie Závěr •Molekulární ekologie se rychle vyvíjí • •Metody se zásadně vylepšují a mění • •Co platilo dnes, nemusí platit zítra • •Těšme se tedy na zítřek! •