Zadání úlohy:
Stanovení efektivního kvantového výtěžku fluorescence (Fn) jako indikátoru tepelného stresu
Efektivní kvantový výtěžek fotochemických procesů On se definuje jako podíl variabilní (Fv') a maximální fluorescence (FM'). Variabilní fluorescencí rozumíme okamžitou hodnotu fluorescence zmenšenou o rovnovážnou úroveň fluorescence naměřené u na světlo adaptovaném vzorku(FS). Pro výpočet používáme hodnotu okamžité fluorescence dosaženou krátce po náhlém ozáření na světlo adaptované rostliny (Fm') dostatečně silným světelným pulzem, který způsobí uzavření všech RC PS II, zahlcení fotochemické deexcitační cesty (veškerý plastochinon v redukovaném stavu), a tudíž prudký nárůst fluorescence na maximální hodnotu Fm'. V tomto stavu jsou všechna RC PS II „uzavřena" a nepřijímají další excitační energii. Variabilní fluorescence se stanoví jako Fm' - FS a efektivní kvantový výtěžek podle vzorce: Fv'/Fm' = (Fm'- Fs) / Fm'
Rovnovážná fluorescence Fs se zjišťuje ozářením na světlo adaptované rostliny velmi nízkou hodnotou záření, při které dochází k excitaci molekul chlorofylu PS II, avšak neuskutečňuje se další přenos této energie na Qa. Fs proto představuje fluorescenci charakterizující běh fotochemických procesů na thylakoidních membránách při dané ozářenosti. Efektivní kvantový výtěžek Fii je jedním z obecných indikátorů popisujících aktuální rychlost (efektivitu) fotochemických procesů na thylakoidní membráně charakteristických pro danou úroveň ozářenosti. Snížení jeho úrovně znamená negativní ovlivnění fotosyntetických reakcí v chloroplastech.
Dobře prostudovaným stresem, jehož důsledkem je snížení hodnoty FII je působení tepelného stresu na rostliny. Rostlinný materiál:
Postup měření:
(1) Zapněte fluorometr PAM-210 a počkejte na ukončení úvodních testů (cca 30s).
(2) V nabídce na displeji fluorometru nastavte intenzity použitých typů světla (opakovaným mačkáním tlačítka „I" na klávesnici fluorometru:
ML - měřící světlo, AL - aktinické světlo, FR - vzdálené červené záření, SP - saturační pulz ML = 8, AL = 3, FR = nenastavuje se, SP = 10 (tj. maximální hodnota)
(3) Zapněte aktinické světlo AL. Na displeji fluorometru bliká symbol „A" za symbolem g v závorce, tj. „g (HA )".
(4) Vložte experimentální list na měřící bod přístroje a přiložte z vrchu magnetickou krytku.
(5) Ponechte experimentální list takto po dobu 3 minut (aklimace).
(6) Po uplynutí doby vymáčkněte na klávesnici fluorometru tlačítko SP
(7) Na displeji přístroje odečtěte hodnotu Fs, Fm', Fii a zaneste do tabulky. List nechte stát při lab. teplotě 5 min.
(8) Experimentální list vložte do sušárny a vystavte po dobu 5 min teplotě 40 °C.
(9) Experimentální list vyjměte a opakujte měření v krocích 4-7.
(10) Opakovaně vložte list do vysoušecí pícky a vystavte po dobu 5 min teplotě 40 °C.
(11) Experimentální list vyjměte a opakujte měření v krocích 4-7.
(12) Vzorek pak nechte volně při laboratorní teplotě a ozářenosti a v 10-ti minutovém intervalu po dobu 30 minut měřte zotavení (recovery) fotochemie po tepelném šoku.
(14) Vytvořte sloupcový graf FS, Fm' FII,v jednom grafu pro kontrolní měření, pro první, druhé tepelné ovlivnění a zotavení.
(15) Formulujte závěr o vlivu tepelného stresu na parametry fluorescence chlorofylu, porovnejte hodnoty získané po 1. a 2. ovlivnění vysokou teplotou (40 °C) a proveďte
také mezidruhové srovnání. Bylo tepelné ovlivnění rostlin ireverzibilní?
Před ovlivněním I. ovliv. 40°C 5 min
II ovliv. 40°C 5 min.
10 min. zotavení
20 min. zotavení 30 min. zotavení
Fm'
Aktuální fluorescence FII ozářenost
F 0234	Y.45	0124
g(L )	1234	2345
Stav		Fm'