BuněčnéBuněčné kulturykultury jakojako nástrojnástroj propro studiumstudium toxickýchtoxických
láteklátek znečišťujícíchznečišťujících životníživotní prostředíprostředí
Biofyzikální ústav AV ČR, v.v.i., Brno
Jan Vondráček
Skupina buněčné a molekulární toxikologie
Oddělení cytokinetiky
Biofyzikální ústav AV ČR, v.v.i.
vondracek@ibp.cz; http://www.ibp.cz/labs/LC/
Activace a účinky AhR:Activace a účinky AhR:
„„Classical“ AhRClassical“ AhR--regulated genes:regulated genes:
contain xenobiotic response elements (XRE) or dioxin responsive elements
(DRE) in their promoter region:
• phase I and II enzymes - CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, UDPglucuronosyltransferase,GST-Ya,
NQO1;
• AhRR.
AhRAhR--regulated genes involved in control of cellregulated genes involved in control of cell
proliferation and cell death:proliferation and cell death:
• pro-apoptotic genes - Bax;
• immediate - early response genes – Jun, Fos;
• cell cycle regulation – p27Kip1, p21Waf/Cip.
„„NonNon--classicalclassical““ AhR ligandsAhR ligands
Expression of dnAhR blocks the proliferative effects ofExpression of dnAhR blocks the proliferative effects of
AhR ligands:AhR ligands:
Andrysík et al., 2006
Andrysík et al., 2007
Doxycyclin - + +
Time (h) 0 24 48
- + - Doxycyclin (48 h)
- - + TCDD (48 h)
Cyclin A
ERK2
DNAsynthesis
(inductionx-fold)
0
1.0
2.0
3.0
4.0
Weiss et al., 2008
Cyclin A/cdk2 activity control is essential for the maintenanceCyclin A/cdk2 activity control is essential for the maintenance ofof
contact inhibition:contact inhibition:
Andrysík et al., 2007
Andrysík et al., 2007
Vondráček et al., 2005
The story is more complexThe story is more complex –– AhR ligands disrupt also control of cellAhR ligands disrupt also control of cell--
toto--cell communicationcell communication –– cell adhesion and gap junctional intercellularcell adhesion and gap junctional intercellular
communication:communication:
Nollet et al., 1999
Interakce AhR a zánětlivých mediátorů v karcinogeneziInterakce AhR a zánětlivých mediátorů v karcinogenezi
Interakce AhR a Wnt signalizaceInterakce AhR a Wnt signalizace
Metodiky:Metodiky:
• kvantitativní real-time RT-PCR, Western blotting;
• průtoková cytometrie, fluorescenční mikroskopie;
• regulace genové exprese – EMSA, ChiP, expresní DNA
mikroarraye;
• manipulace genové exprese – siRNA, transientní a stabilní
transfekce buněk;
• in vitro buněčné kultury, in vivo pokusy, práce s klinickým
materiálem;
• in vitro testy toxicity