FETAX Frog Embryo Teratogenesis Assay-Xenopus Vypracovali: Jakub Kubačka Martin Steček Test embryotoxicity a teratogenity na drápatce vodní • Test se provádí podle metodiky ASTM (American Society for Testing and Materials) • Prováděn na ranních vývojových stádiích – embryích drápatky vodní • 96 hodinový akutní test, slouží k odhadu rizika embryotoxicity a teratogenity • Drápatka vodní slouží jako modelový organismus – možná extrapolace výsledků na jiné organismy včetně savců s 85% pravděpodobností Drápatka vodní • Původem Středoafrický druh • 10-15 cm (samci 2/3) • Pohlavní dospělost v 10- 12 měsících • Zajímavost: v minulosti využívány jako těhotenský test Chov drápatky vodní • Izolace od denního světla • 4-6 kusů na min. 1,8 litrové aquarium • Teplota vody 23 +/- 3 °C • Čistá voda stabilní kvality, nejlépe z přírodního zdroje – ne povrchová • Krmná směs: hovězí játra + vitamínová směs Příprava testu – rozmnožování • Umístění v aquariích po párech • Teplota 21 +/- 2 °C • Navození páření: lidský Choriogonadotropin: samci 250-500 IU, Samice 500-1000 IU. Koncentrace: 1000 IU/ml v 0,9% roztoku NaCl • Snůška vajec po 9-12 hodinách • připuštění pouze dokonale kruhové snůšky Roztok FETAX NaCl 625 mg NaHCO3 96 mg KCl 30 mg CaCl2 15 mg CaSO4.2H2O 60 mg MgSO4 75 mg H2O 1000 ml pH 7,6 – 7,9 Příprava embryí • Oddělení vajíček ze snůšky v 2% L-cysteinu – 1-3 min. (pH roztoku 8,1) • Separace deformovaných embryí • Vhodné stádium pro začátek testu: střední blastula – ranní gastrula (8-11 stádium vývoje) • Přechovávání v FETAX roztoku Vývojové stádia • Začátek testu: • Ukončení testu: Test • Petriho misky, 25 embryí, 10 ml roztoku • Min. dvě opakování pro každou koncentraci • Negativní kontrola pouze s roztokem FETAX • Pozitivní kontrola – 6-aminonicotinamid (LC50 2,23 mg/ml, EC50 0,005 mg/ml) • Teplota 24 +/- 2 °C • pH optimum 7,7 – v rozmezí 6,5-9 • Doba trvání testu – 96 hodin • Dosažení 46 stádia u negativní kontroly • Výměna roztoku každých 24 hodin + vyjmutí mrtvých embryí Vyhodnocení • Ukončení testu: fixace živých embryí v 3% formaldehydu • Úmrtnost • Malformace: „Atlas of Abnormalities – John A. Bantle“ • Inhibice růstu Validita testu • Embrya od jednoho páru • Přežití kontroly > 90%, malformace < 10% • Dodržení pH limitu: 6,5-9,0 • Vyjímání mrtvých embryí • Dodržení teplotního limitu: 24 +/- 2 °C Test s MAS • Metabolic Activation System • Při testech pro humánní embryotoxikologii • Simulace savčího metabolismu (cytochrom P-450) • Extrakt z potkaních jater (indukce detoxikačního mechanismu: Aroclor 1254) • NADPH • Úprava dávkování roztoku z 10 na 8 ml • Ještě větší důraz na aseptickou práci • Přidání protilátek: penicilin-streptomycin Použité zdroje • http://drapatka.ic.cz/?strana=2 • http://drapatka.ic.cz/?strana=7 • http://drapatka.ic.cz/?strana=7 • https://is.muni.cz/auth/el/1431/jaro2010/Bi5620/um/Ekotoxbiotesty • http://www-cbd.ups- tlse.fr/organismes/nieuwkoop/nieuwkoop.html Děkujeme za pozornost