Stanovení inhibičního účinku vzorků vod na světelnou emisi Vibrio fischeri Zkouška na luminiscenčních bakteriích ČSN EN ISO 11348-3 ISO 11348-3:1998 ISO 11348 • ISO 11348-1 postup pro čerstvě připravené bakterie • ISO 11348-2 postup pro sušené bakterie • ISO 11348-3 postup pro lyofilizované bakterie Metoda je použitelná pro: Odpadní vody Vodné výluhy Sladké, slané a brakické vody Pórové vody Podstata zkoušky • Stanovení inhibice emise světla kultury Vibrio fischeri v koncentrační řadě • Zkušebním kritériem je snížení luminiscence po expozici 15 a 30 min nebo volitelně po 5 min • Inhibice vzorkem je vyjádřena jako ředění vyvolávající 20% a 50% inhibici emise světla v porovnání s kontrolou Rušivé vlivy • Nerozpustné, málo rozpustné, těkavé látky, látky reagující s ředící vodou, zkušební suspenzí, měnící své složení v průběhu zkoušky • Silně zbarvené nebo zakalené vzorky • Vzorky s vysokou spotřebou kyslíku • Znečištění vzorku organickými dobře biologicky rozložitelnými živinami • Koncentrace solí přesahující 30 g/l Chemikálie a materiály • Bakterie Vibrio fischeri NRRL B-11177 – Uchovávané v mrazničce při -18 až -20°C • Roztok NaCl – ředící voda • Roztok NaOH • HCl – Pro úpravu pH • Médium pro lyofilizované bakterie (NaCl, MgCl2.6H2O, KCl) • Srovnávací látky (ZnSO4.7H2O, C6H4OCl2, K2Cr2O7) Přístroje a pomůcky • Mraznička • Chladnička • Termoblok s řízenou teplotou • Luminometr • pH-metr • Chlazená odstředivka • Konduktometr • Stopky • Automatické pipety • Zkušební zkumavky Odběr a úprava vzorků • Odběr vzorku – Odběr do chemicky inertních a čistých nádob, po okraj nádoby, těsné uzavření – Testování co nejdříve po odběru, případné uchovávání 48hod v 2-5°C, do 2 týdnů v –20°C • Úprava vzorku – Optimální pH 6-8,5 (úprava HCl, NaOH) – Na litr vzorku vody přídavek 20 g NaCl, u brakických a slaných vod změřena salinita – U silně zakalených vzorků usazování 1 hod, případně odstředění nebo filtrace Postup • Příprava zásobní suspenze – K lyofilizované kultuře bakterií je do temperovaných zkumavek přidána destilovaná voda rehydratovaná suspenze • Příprava zkušební suspenze (50:1) A) Zkušební zkumavky – do vytemperovaných zkumavek je k médiu přidána zásobní suspenze B) Enlenmayerova baňka – k médiu je přidána zásobní suspenze a ve stejném časovém intervalu pozdějšího měření intenzity je do temperovaných zkumavek odměřeno 500 µl zkušební suspenze Postup zkoušky • Vzorky z postupně celé ředící řady se vloží do luminometru (adaptace nejméně 15 minut) a měří se intenzita luminiscence jednotlivých vzorků a to ve stejných časových intervalech (doporučeno 20 s) • Znovu se intenzita luminiscence měří po 15 a 30 min, popř. volitelně po 5 min Vyhodnocení • Výpočet průměrného inhibičního účinku Ht v procentech (vzorce uvedené v normě). • Stanovení hodnot EC (nejčastěji EC20 a EC50) Platnost zkoušky • Hodnota fkt pro 30 min inkubaci je v rozsahu 0,6 – 1,8 • Paralelní stanovení se neodchylují od svých průměrů o více jak 3 %. • Tři srovnávací látky způsobují při 30 min expozici inhibici 20 – 80 % v následujících koncentracích: - 3,4 mg/l 3,5-dichlofenolu - 2,2 mg/l Zn2+ (jako heptahydrát síranu zinečnatého) - 18,7 mg/l Cr6+ (jako dichroman draselný) Protokol o zkoušce • Identifikace vzorku vody, včetně podmínek vzorkování a doby a podmínek uchovávání • Hodnotu PH původního vzorku • Datum provedení zkoušky • Úprava vzorku (pokud byla provedena) • Původ bakterií, číslo šarže, datum přípravy bakterií popř. teplota uchování bakterií, pokud byly zmraženy • Výsledky (dle kapitoly 10) + výsledky zkoušek se srovnávacími látkami • Jakékoli odchylky