ČSN EN 28692
Zkouška inhibice růstu sladkovodních řas
Scenedesmus subspicatus a Selenastrum capricornutum (ISO 8692:1989)
Ing. Miroslav Plotěný
ČSN EN 28692
● Přijatá organizací CEN v roce 1993.
● Určuje metodu stanovení toxických účinků chemických sloučenin
na růst planktonních sladkovodních řas.
● Podstata spočívá v inhibici růstu jednodruhového řasového kmene,
kultivovaného v přesně stanovených podmínkách v koncentrační
řadě zkoušené látky.
ČSN EN 28692
Potřebné roztoky:
● Zkušební organismus – planktoní zelené řasy Scenedesmus subspicatus
a Selenastrum capricornutum
● Voda – u živného substrátu a roztoku zkoušených látek se používá
deionizovaná voda nebo voda obdobné jakosti.
● Živiny a jejich roztoky – 4 zásobní roztoky dle daných koncentrací
chemických látek jakosti p.a. daných normou, které jsou nutné
sterilizovat membránovou filtrací nebo v autoklávu (4. roztok ale nelze)
...
Pozn.: Nutno dávat pozor na znečištění organickými a anorganickými látkami
během přípravy a skladování. Vyvarovat se zařízením obsahující měď.
ČSN EN 28692
Přístroje a pomůcky:
● Klimatizovaný box nebo přizpůsobená místnost (zářivka, neměnné
podmínky,...)
● Přístroje pro měření množství buněk řas (počítač částic, mikroskop,...)
● Filtrační aparát pro membránové filtry 0,2 μm
● Kultivační nádoby ( Erlnmayrovy baňky 250ml,
zátky propouštějící vzduch)
● Autokláv
● pH-metr
ČSN EN 28692
Postup zkoušky:
● Zásobní roztok živin – vždy čerstvý, před použitím 30 min.
provzdušňovat nebo ponechat přes noc v kontaktu se vzduchem.
Pomocí hydroxidu sodného nebo kyseliny chlorovodíkové se pH upraví
na hodnotu 8,3±0,2.
● Příprava inokula – 1díl zásobního roztoku na 8 dílů vody, který se
doplní inokulační kulturou v exponenciální fázi růstu na koncentraci
10000 buněk na ml
● Volba koncentrační řady – dle předběžné zkoušky...
● Příprava zásobních roztoků zkoušené látky – roztok, který dále
ředíme
● Příprava zkušebních roztoků – výsledný objem by měl být stejný
(6x kontrola, 3x každá koncentrace)
Inkubace:
Teplota 23±2°C
Bílé světlo od 400 nm do 700 nm
Světelná intenzita od 60 do 120 μE/m2.s
Lze využít Luxmetrů pak ideální rozsah
od 6000 do 10000 lx.
Třepat, míchat nebo provzdušňovat – pro
zajištění výměny plynů a udržení pH.
Měření:
Minimálně po 24 hod., vzorek odebrat
pipetou a nevracet zpět. Ukončení nejdřív
po 72 hodinách.
ČSN EN 28692
Zkouška se považuje za neplatnou když:
pH se změní o více než 1,5 jednotky
hustota buněk u kontroly se musí zvýšit minimálně 16krát za 72 hodin.
Vyjádření výsledků:
● Vyměření růstových křivek
● Výpočet inhibice v procentech
- plocha pod růstovou křivkou EbC50 (integrál biomasy)
- růstová rychlost ErC50
● Určení EC50
● Určení NOEC (NOEbC, NOErC)
ČSN EN 28692
Protokol o zkoušce:
● zkoušená látka;
● zkušební organismus (druh, původ, způsob kultivace,...);
● podrobné údaje o zkoušce ( začátek a konec pokusu, teplota, pH,
koncentrační řada, složení média, intenzita a jakost osvětlení, metoda
měření, inkubační zařízení...);
● výsledky (hustoty buněk v každé baňce, průměrné hustoty pro
koncentraci, růstové křivky, vztah mezi koncentrací a účinkem, hodnoty
EC50 a NOEC, ostatní pozorované účinky;
● další skutečnosti významné z hlediska užitého postupu.
Miniaturizace – sérologické destičky
Rozměr 9x12 cm
96 jamek o objemu 0,25 ml
Praktická ukázka s dichromanem draselným
● koncentrační řada:
20; 10; 5; 2,5; 1,25; 0,625 a 0,3125 mg/l;
● ZBB médium sterilizované v autoklávu;
● zkušební organismus Scenedesmus subspicatus;
● osvětlení standardní zářivka 40 W.
EC50 = 5,5 mg/l
NOEC = 2,5 mg/l
Závislost inhibice na koncentraci dichromanu draselného
-20
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Koncentrace mg/l
Inhibice%