Ekotoxikologické biotesty s ptáky a savci Ptáci a • Sekundární a terciární konzumenti • Druhy z řádu dravců a sov, šelmy - konečný článek potravní pyramidy • Delší doba života -potenciál bioakumulace • ? zakoncentrování/ metabolizace látek v potravních řetězcích Ptáci - skupina necílových organismů pro pesticidy Primární intoxikace Sekundární intoxikace Údaje o toxicitě látek pro ptáky jsou nenahraditelné - akutní toxicita - chronická toxicita Riziko pro poškození ptačích populací Divocí ptáci v prostředí Druhy citlivé na pesticidy, těžké kovy, POPs, sinicové toxiny Především rybožravé druhy - vrchol potravního řetězce • Vliv na centrální nervový systém • Změny chování • Poruchy smyslů • Endokrinní účinky • Poruchy reprodukce • Mortalita embryí • Malformace embryí Snížení reprodukční kondice populací Testy toxicity na volně žijících ptácích Cíl: hodnocení vlivu antropogenních kontaminantu (pesticidy, odpady atd.) podpora registrace takových nových látek a přípravků, které: • mohou představovat chronickou expozici ptáků • jsou persistentní • se mohou kumulovat v rostlinách a zvířatech • vykázaly vliv na reprodukci laboratorních savců. 2 základní typy studií: "screening field studies" - +/- toxicita? Mortalita, pohybová aktivita „definitive field studies" - ? rozsah poškození? Biodiverzita, abundance, biochemie krve, orgánů, hnízdní a pohybová aktivita, aktivita páření, počet vajec, síla skořápky, líhnivost Testy toxicity na ptácích OECD guidelines Section 2: Effects on Biotic Systems • OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS 205, 1984: Avian dietary toxicity test • OECD GUIDELINE FOR TESTING OF CHEMICALS 206, 1984: Avian reproduction test EPA Series 850 Ecological Effects Test Guidelines 850.2100 Avian acute oral toxicity test 850.2200 Avian dietary toxicity test 850.2300 Avian reproduction test 850.2400 Wild mammal acute toxicity OECD 205 Avian dietary toxicity test. Test akutní perorální toxicity u ptáků Testovací organismy: křepelka japonská (Coturnix coturnixjaponica), bažant obecný (Phasianus colchicus), (případně: koroptev, vrána, kavka, špaček, racek, vlaštovka, kos, drozd, pěnice, holub, káně, poštolka, volavka, kormorán). Design: ptáci ze stejné populace, 10-17 dní staří, známý původ Před testem min.7 dní aklimatizace, na začátku zvážení jedinců, (U volně žijících ptáků: večerní odlov, jedinec dostane při svítání jednorázově dávku v kap suli). Osvětlení 12 až 16 hodin denně Expozice v potravě 5 dní (120 hodin), pak 3 dny krmná směs bez testované látky Min. 5 koncentrací látky v krmivu (limitní test 5000 ppm) - příprava rovnoměrným rozmísením testované látky se základní krmnou směsí Pokud dochází k úmrtí 7 a 8 den, prodloužení testu, až když 2 dny po sobě bez mortality, max. 21 dnů 10 jedinců na 1 klec Vazem křepelek Hmotnost těla je zjišťována: I 1. O.den 2. 5.den 3. 8.den 4. na konci testu, je-li prodloužen EPA 850.2100: Avian Acute Oral Toxicity Test min. 14 dní aklimatizace, expozice kapsulí nebo gaváží Mladí dospělci, min.16 týdnů Min. 14 dní expozice Není-li známo rozmezí koncentrací - předběžný test - doporučeno 2, 20, 200, 2000 mg/kg b.w. (pokud očekávána nízká toxicita stačí limitní test 2000 mg/kg b.w. Definitivní test: 5 koncentrací, 10 jedinců na koncentraci - dávkování na tělesnou hmotnost Akutní test toxicity u ptáků Během testování se sleduje: Příznaky intoxikace a abnormality v chování Mortalita Hmotnost těla v OECD 205: 0.- 5., 8. den a na konci testu, je-li prodloužen Spotřeba krmiva v OECD 205: 0.-5., 5.-8. den, 8.-poslední den testu, je-li prodloužen Vyhodnocení: doba od aplikace k prvním příznakům toxicity mortalita - LC50 (V OECD 205: 24hl_C50, 48hl_C50, 78hl_C50, 96hl_C50, 120hl_C50) doba potřebná pro detoxikaci a obnovení fyziologických funkcí Validita testu: Mortalita kontrolních jedinců nepřekročila 10% Koncentrace látky v krmivu neklesla pod 80% Single-Dose Avian Embryotoxicity and Teratogenicity Test Cíl: stanovení toxicity látky při přímé aplikaci na skořápku Organismus - kachna divoká Princip - přímá aplikace na skořápku (ropa, pesticidy, DDT, PCB) Vyhodnocení: • líhnivost • nekrozy jater • biochemické markery • morfologické abnormality • poruchy pohybu a metabolismu OECD 206 Avian reproduction test (US EPA Avian chronic toxicity test.) revidován - připravována nová verze: Avian reproduction toxicity test in the Japanese Quail or Northern Bobwhite Cíl: stanovení reprodukční toxicity látky podávané rodičovským jedincům. Testy zahrnují účinky na reprodukci, fertilitu a teratogenitu podpora registrace takových nových látek a přípravků, které: • mohou představovat chronickou expozici ptáků • jsou persistentní • se mohou kumulovat v rostlinách a zvířatech • vykázaly vliv na reprodukci laboratorních savců. Testovací organismus : kachna divoká, koroptev polní, křepelka 14 dní adaptace Test reprodukční toxicity (OECD 206) Design: minimálně 3 koncentrace látky v potravě, dle předběžných laboratorních testů (ryba, krysa), nebo takové, které jdou 5x vyšší, než aktuální koncentrace dle analýz Nejlépe dle výsledků akutního perorálního testu toxicity (OECD 205) - nejvyšší koncentrace cca Vi LC10 Expozice připravena rovnoměrným rozmísením testované látky se základní krmnou směsí Ptáci v klecích v párech Na každou koncentraci aspoň 12 párů - expozice začíná 10 týdnů před hnízděním a pokračuje 1-3 měsíce ve snáškové sezóně, indukce snášky prodloužením fotoperiody - vejce jsou denně odebírány a uskladněny, kontrola prosvícením proti prasklinám každý týden či 14 dní dány na inkubaci v líhni V 6.-14. dni kontrola prosvícením Přemístění z inkubátoru do líhně (např. u křepelky 16.den) Vylíhlá mláďata se chovají 14 dní na adekvátní dietě Test reprodukční toxicity (OECD 206) V průběhu testu se sleduje: S mortalita dospělců S příznaky intoxikace S hmotnost těla dospělců S produkce vajec S výskyt křapek S tloušťka skořápky S oplozenost vajec S líhnivost kuřat S hmotnost těla mláďat S spotřeba potravy dospělci, mláďaty S Makroskopické patologické vyšetření - dospělci Vyhodnocení: Mortalita, počet vajec, sila skořápky, % oplodněných líhnivost, % živých mláďat po 3 a 14 dnech malformace, deformace oči, mozku, nohou a křídel, • biochemické márkery (bilirubin, AP, AST, GST, DNA aducts..) 9717 VETERINÁRNI A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO ŠKOLNÍ ZEMĚDĚLSKÝ PODNIK NOVÝ JIČÍN JINACOVICE Aviární testy Testy jsou prováděny na základě: S akreditačního osvědčení a schváleného Projektu pokusu podle § 12 vyhlášky č. 311/97 Sb., o chovu a využití pokusných zvířat S pověření podle § 40 zákona 147/96 Sb. k ověřování vlastností přípravků na ochranu rostlin Pokusná Místnost Regulace teploty - optimum dle druhu a stáří organismu Vlhkosti (50-75%) Světelného režimu (12-16 hod světla) Dobrá ventilace Test atraktivnosti různých rodenticidů pro ptáky (BB A - metodika) (Biologische Bundesanstalt für Land und Forstwirtschaft (BBA) in Braunschweig, Germany) - zjistit, zda je testovaná látka přijímána v množství, které způsobuje příznaky otravy nebo mortalitu - prognóza rizika akutních otrav ptáků v reálny podmínkách - venkovní voliéry - bažanti, křepelky, holub domácí - adaptace 1 týden -16 hod. hladovění, 8 hodin expozice - 3x po sobě Pak 14 dní pozorovací doba I—I f 1 & i" n £JS '. • " äü Sk ^JK Pozorování • 1. hod expoziční fáze se ptáci pozorují trvale • Následujících 7 hod. lxzahod. • Cyklus se opakuje 3 dny po sobě • Na poslední expoziční fázi navazuj e 14 denní pozorování Vyhodnocení testů • Test akutní perorální toxicity (OECD 205) probitová analýza (graficky n. PC) LC50 • Test na atraktivitu (BBA-metodika) pokusná zvířata (druh, původ, věk) popis voliér a podmínky testu vč. údajů o počasí poznatky z pozorování - jak byla přijímána testovaná substance změny v chování, příznaky otravy tělesná hmotnost testovacích jedinců mortalita a makroskopický patologický nález Testování toxicity na savcích Celá řada normovaných testů na laboratorních savcích Využití: medicína, farmacie, chemický výzkum, humánní toxikologie.... • ČSN ISO • EPA • OECD In vivo, in vitro testy, specifické účinky - neurotoxicita, teratogenita, genotoxicita, karcinogenita Akutní, subakutní, chronická toxicita Orální, dermální, inhalační toxicita r 's/ VYHLÁŠKA 443 / 2004 kterou se stanoví základní metody pro zkoušení toxicity chemických látek a chemických přípravků B.l bis Akutní toxicita orální (per os) - metoda fixní dávky B.l tris Akutní toxicita orální (per os) - metoda stanovení třídy akutní toxicity B.2 Akutní toxicita inhalační B.3 Akutní toxicita dermální B.4 Kožní dráždivost B.5 Oční dráždivost B. 6 S enzibilizace kůže B.7 Subakutní toxicita orální (per os) (28 denní opakovaná aplikace) B.8 Subakutní toxicita inhalační (28 denní opakovaná aplikace) B.9 Subakutní toxicita dermální (28 denní opakovaná aplikace) B. 10 Mutagenita - test chromozómových aberací u savčích buněk in vitro B. 11 Mutagenita - test chromozómových aberací v kostní dřeni savců in vivo B. 12 Mutagenita - in vivo mikronukleus test v savčích erytrocytech B. 17 Mutagenita - test genových mutací v savčích buňkách in vitro B. 18 Poškození DNA reparace - neplánovaná syntéza DNA - savčí buňka in vitro B. 19 SCE - výměna sesterských chromatid in vitro B .21 Test transformace savčích buněk in vitro B.22 Dominantní letální test u hlodavců B.23 Analýza chromozómových aberací u savčích spermatogonií B .24 Spot test u myší B.25 Přenosné translokace u myší B.26 Test subchronické orální toxicity (90 denní studie orální toxicity s opakovanou aplikací hlodavcům B.27 Test subchronické orální toxicity (90 denní studie orální toxicity s opakovanou aplikací hlodavcům B.28 Subchronická toxicita dermální (90 denní opakovaná aplikace, studie na hlodavcích) B.29 Subchronická toxicita inhalační (90 denní opakovaná aplikace, studie na hlodavcích) B.30 Testování chronické toxicity B. 31 Studie teratogenity B.32 Test karcinogenity EPA Office of Prevention, Pesticides and Toxic Substances (OPPTS) - guidelines organizovány do 10 serii: 850 - Ecological Effects Test Guidelines 870 - Health Effects Test Guidelines 870.1000 Acute toxicity testing—background 870.1100 Acute oral toxicity 870.1200 Acute dermal toxicity 870.1300 Acute inhalation toxicity 870.2400 Acute eye irritation 870.2500 Acute dermal irritation 870.2600 Skin sensitization 870.3050 Repeated dose 28-day oral toxicity study in rodents 870.3100 90-Day oral toxicity in rodents 870.3150 90-Day oral toxicity in nonrodents 870.3200 21/28-Day dermal toxicity 870.3250 90-Day dermal toxicity 870.3465 90-Day inhalation toxicity 870.3550 Reproduction/developmental toxicity screening test 870.3650 Combined repeated dose toxicity study with the reproduction/developmental toxicity screening test 870.3700 Prenatal developmental toxicity study 870.3800 Reproduction and fertility effects 870.4100 Chronic toxicity 870.4200 Carcinogenicity 870.4300 Combined chronic toxicity/carcinogenicity 870.5195 Mouse biochemical specific locus test 870.5200 Mouse visible specific locus test 870.5300 In vitro mammalian cell gene mutation test 870.5375 In vitro mammalian chromosome aberration test 870.5380 Mammalian spermatogonial chromosomal aberration test 870.5385 Mammalian bone marrow chromosomal aberraton test 870.5395 Mammalian erythrocyte micronucleus test 870.5450 Rodent dominant lethal assay 870.5460 Rodent heritable translocation assays 870.5550 Unscheduled DNA synthesis in mammalian cells in culture 870.5575 Mitotic gene conversion in Saccharomyces cerevisiae 870.5900 In vitro sister chromatid exchange assay 870.5915 In vivo sister chromatid exchange assay 870.6100 Acute and 28-day delayed neurotoxicity of organophosphorus substances 870.6200 Neurotoxicity screening battery 870.6300 Developmental neurotoxicity study 870.6500 Schedule-controlled operant behavior 870.6850 Peripheral nerve function 870.6855 Neurophysiology Sensory evoked potentials 870.7200 Companion animal safety 870.7485 Metabolism and pharmacokinetics 870.7600 Dermal penetration 870.7800 Immunotoxicity 870.8355 Combined Chronic Toxicity/Carcinogenicity OECD guidelines - Section 4: Health Effects 402 Acute Dermal Toxicity 403 Acute Inhalation Toxicity 404 Acute Dermal Irritation/Corrosion 405 Acute Eye Irritation/Corrosion 406 Skin Sensitisation 407 Repeated Dose 28-day Oral Toxicity Study in Rodents 408 Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in Rodents 409 Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in Non-Rodents 410 Repeated Dose Dermal Toxicity: 21/28-day Study 411 Subchronic Dermal Toxicity: 90-day Study 412 Repeated Dose Inhalation Toxicity: 28-day or 14-day Study 413 Subchronic Inhalation Toxicity: 90-day Study 414 Prenatal Developmental Toxicity Study 415 One-Generation Reproduction Toxicity Study 416 Two-Generation Reproduction Toxicity Study 417 Toxicokinetics 418 Delayed Neurotoxicity of Organophosphorus Substances Following Acute Exposure 419 Delayed Neurotoxicity of Organophosphorus Substances: 28-day Repeated Dose Study 420 Acute Oral Toxicity - Fixed Dose Method 421 Reproduction/Developmental Toxicity Screening Test 422 Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Reproduction/Developmental Toxicity 423 Acute Oral toxicity - Acute Toxic Class Method 424 Neurotoxicity Study in Rodents 425 Acute Oral Toxicity: Up-and-Down Procedure 426 Developmental Neurotoxicity Study " 427 Skin Absorption: In Vivo Method 428 Skin Absorption: In Vitro Method 429 Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay 430 In Vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test (TER) 431 In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test 432 In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test 435 In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion 440 Uterotrophic Bioassay in Rodents: a short-term screening test for oestrogenic properties 451 Carcinogenicity Studies (Original Guideline, 452 Chronic Toxicity Studies (Original Guideline, 453 Combined Chronic Toxicity/Carcinogenicity Studies 471 Bacterial Reverse Mutation Test (Updated Guideline, adopted 473 In vitro Mammalian Chromosomal Aberration Test (Updated Guideline, 474 Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test 475 Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test 476 In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test 478 Genetic Toxicology: Rodent Dominant Lethal Test 479 Genetic Toxicology: In vitro Sister Chromatid Exchange Assay in Mammalian Cells 480 Genetic Toxicology: Saccharomyces cerevisiae, Gene Mutation Assay 482 Genetic Toxicology: DNA Damage and Repair, Unscheduled DNA Synthesis in Mammalian Cells in vitro 483 Mammalian Spermatogonial Chromosome Aberration Test 484 Genetic Toxicology: Mouse Spot Test 485 Genetic Toxicology: Mouse Heritable Translocation Assay 486 Unscheduled DNA Synthesis (UDS) Test with Mammalian Liver Cells in vivo Testy toxicity na volně žijících savcích (EPA 850.2400 Wild mammal acute toxicity) Cíl: ověřit v přírodních podmínkách výsledky laboratorních testů na hlodavcích V případě látek, které jsou přímo vnášeny do přirozeného prostředí druhu Testovací organismy: volně žijící hlodavci - myš, hraboš, zajíc, králík, dále fretka, liška, lovná zvěř, (US - norek, skunk, bobr) - vybrat dle relevantnosti pro danou látku a prostředí aplikace Design: 28 dnů expozice v klecích, přírodní podmínky, dávkování do vody a potravy Vyhodnocení: mortalita, ovogeneze, spermatogram, reprodukční aktivita, vývoj embryí, biochemie krve a orgánů (slezina, játra). Volně žijící savci jako model v biomonitoringu v Studovaná oblast - severozápadní Čechy 30°42'N13°364 Krušné hory, Mostecká pánev Metody testy mutagenních vlivů vnějšího prostředí aberace chromosomů v somatických a pohlavních buňkách výskyt mikrojader v somatických buňkách (mikronucleus test) abnormality spermií rezidua těžkých kovů základní údaje z populační ekologie Modely rejsek malý (Sorex minutus) rej sek obecný {Sorex araneus) hraboš polní {Microtus arvalis) norník rudý {Clethrionomys glareolus) myšice lesní {Apodemus flavicollis) Numerické anomálie pohlavních chromosomu hraboš polní Česká republika n u i\ n m.......... W M m u AA X* ** Í*' A* • p * «X «A -Nft *■ ** ** Ali »" ** A' X M M «K SR - „ p.. m i- W IX I« U K am HR AA ä>* ti Ka *« ** •* p AA * <\ a ^ 4 m+> MA tt* *■ ** ■* ** Zima J et al., Hereditas 117: 203-207 (1999) Výskyt abnormálních spermií myšice lesní a norník rudý Krušné hory vs. Labské pískovce průměrné frekvence abnormálních spermií na 1500 buněk DRUH N (jedinci) průměr SD Apodemus flavicollis vzorek kontrola 28 27 14,00 * 8,45* 4,56 8,37 Clethrionomys glare olus vzorek kontrola 30 32 5,75 5,18 5,28 3,86 leradi LA et al., Folia Zool 52: 57-66 (2003) Rezidua těžkých kovů rejsek malý - Sorex minutus -játra [ppm, dry weight] průměr SD min max vzorek Cd Pb 3,3 836,2 3,7 415,9 0 282,0 9.7 1614.4 kontrola Cd Pb 4,7 29,5 4,7 13,2 0 11,9 34,9 63,4 Tomášková L et al., Carnegie Museum Special Publications (v tisku) Rezidua těžkých kovů rejsek obecný - Sorex araneus - ledviny [ppm, dry weight] průměr SD min max vzorek Cd Pb 23,3 321,4 43,1 295,7 0 0 149,9 1187,7 kontrola Cd Pb 5,4 193,2 9,0 299,0 0 0 38,5 779,8 Tomášková L et al., Carnegie Museum Special Publications (v tisku) v • žádný detekovatelný vliv na - poměr pohlaví - populační strukturu - reprodukci - denzitu a produktivitu • sestupný trend abundance - snižování kvality stanoviště v důsledku znečištění - sukcese rostlinných společenstev ní ekologie Závěry úroveň kontaminace těžkými kovy indikuje vážné poškození zdravotního stavu základní demografické parametry populace nevykazuj í známky narušení vlivy znečištění a narušování stanovišť se projevují na úrovni jedince, ale nejsou zřetelné na úrovni populace Další zdroje informací z monitoringu/bioindikací • analýzy kostí a tuku dlouho žijících zvířat (více než 4 roky -jelen, prase divoké, spárkatá zvěř, vrány, kavky hnízdící na urč. Teritoriu) • koloniálně hnízdící ptáci - rackové, kormoráni a populace hrabošů-vývoj mláďat- mortalita, teratogenita • vnitřnosti lovné zvěře (monitoring) • odlov hrabošů z přírody - • struktura populací • bioakumulace PAU, PCB, DDT, TK.... • Biochemie+ genetika krve Bioindikace nejsou biotesty!!!!