Experimentální modely
ekotoxicity pro
bezobratlé živočichy
Bezobratlí živočichové
•   Přítomnost a aktivita bezobratlých je naprosto rozhodující pro stav ekosystému.
•   Bezobratlé najdeme ve všech ekosystémech.
•   Bezobratlí tvoří významnou část celkové biomasy v terestrických i akvatických ekosystémech, mají nepoměrně vyšší druhovou bohatost oproti obratlovcům.
•   Hrají významnou roli v potravním řetězci jako destruenti, ale i konzumenti prvního a druhého řádu, s čímž je spojená možná bioakumulace.
•   Díky změnám habitatu při metamorfóze mohou zasahovat do více ekosystémů i během jednoho životního cyklu, díky čemuž mohou přijímat široké spektrum polutantů a přenášet je mezi jednotlivými ekosystémy.
Testy ekotoxicity v půdě
hlístice
Půdní testy s bezobratlými
Uspořádání: umělý substrát, vlhčená petriho
miska, standardní nebo přírodní půda - různé
nádoby...
- zpravidla 14 dní (letalita),
56 dní - reprodukce ...                                 roupice
Organismy
Kroužkovci - žížaly, háďátka, roupice
Hmyz - Chvostoskoci (Collembola)
zízaly
chvostoskoci
f'SŕT l-*í&ř*!
TERESTRICKÉ PROSTREDI - konzumenti - bezobratlí
Zejména pro testování biocidů
VČELY
- testování insekticidů
- dávkování v potravě
Moucha domácí
ESI:
Unlvtrítiy »rNtbr»Ka Qtjuilnittti tf Entomology
Drosophila
(hodnocení genotoxicity)
;/
Testy s vodními bezobratlými
Stanovení akutní či prolongované toxicity: chemických látek, výluhů z pevných matríc průmyslových či komunálních odpadních vod povrchových nebo podzemních vod
Table 1, Off^PMVI-JNii scientific namts nfimyGT'tcbrtltt& Ľíŕrf farGťdiŕť toxicity íŕJŕj'nf.1
llrrlŕr frfiiii. jnri «par i no	OoHnHním nimi
Anualr&ci	lairj1 ahrimpi
Strwp ro i -ff. ji u i u.% f i ■ 11 i ľ	
CUACOTft	DajrfiniťL
ítn^vcjřOiřťLř» air' uíuilaa	
{)apÍ\nÍQ nwjipm	
ftrpJinia JHJÍC.T	
Ctolrnroda	5«d shriirpn
fypri/lnptii uut\rf	
ľíwpfldn	ftůwhup
.4yeŕUí-? ŕ"*LJn]Ľdij5	
Amphj[fOdz	Scuis
ír'n T] TlCrt J DJÍ Ľff]piiinHdÍlKK	
Om-'H TIÜTVP !í!i i   .' ■■	
^'H^Tnanií /ukmJ\uj(	
Ľfce&poda	
tfrranccrŕj juií	CrniTisb
JtTCUJnŮťLTLjJC f p	Croytinb
J'ji'ťl-i Ml- -ri '-ľv- ttnfi. :ili .■   ■ .	Glissfllirirnn
t_ya ■í.-uiii'iiTi'jiliVi
^cron*ü™i*fi.
íľlfliU flůlUff .H n (hm ti« Jt^pi/lů Ůp.
Elŕhŕrrtťrur^frn /ÍMfl^ícni'a At Ediuatd
ÜdcfiDly
fsľ.Ajliinri nfvutofa
Tricboptů« ■F/yuJi-fl^fycn.f up.
■■■■■■■■,■ Á -." ;.: ip.
DijUern TSpuJa sp.
ťľAuu ůunu ^j|> ŕ'f »ILcjkku.v: pp.
CAthi^y^aj JpÍĽf/TWJIlíf
A rímr uúsi'tfdJla
SLonflíbw
Mojíftiťs
DniifDiillifiF.
D*mp*lfly
Darcuttlíly
Cnn? flics
rhnoLorujnlfl^Pí
ladu
Snipe Fly
'ľhí following Ute aLigfiflí JTiv^rtíbTůfeů were luted: cLaph-HHÍ5-ÍUutunuEarLTJ>El?h-«(TLy Iflůtdr: utonjefly-Eirsí ynu ílůis íl-30 nunlutígl, Mťond ygar clů*4 (20-40 mm kngl; uicl mjra(pp-f«irth Lnaur. All uthůr Jrevertehrojlti wtrn rk*]g. ha [cd Ai nidfld, juvenil*, <* tobHutil
Testy toxicity na vodních bezobratlích
Normy testů na bezoobratlých:
ČSN EN ISO, OECD, ASTM, US EPA, TNV, EEC, AFNOR
Testy na korýších (Crustacea) -planktonni- nejčastější
Daphnia magna, D. pulex, Ceriodaphnia dubia, Artemia šalina (mořská),
Thamnocephalus platyurus
Testy na vířnících (Rotifera) - Brachionus calyciflorus Testy na kroužkovcích (Annelida) - Tubifex tubifex Testy na hmyzu (Insecta) - Chironomus tentans
Testy na měkkýších (Mollusca)
Potamopyrgus antipodarum
Testy na bentických korýších (Crustacea)
Gammarus, Hyallela azteca
Daphnia magna
Ceriodaphnia dubia
Gammarus
Artemia šalina
Hrotnatka velká {Daphnia magna)
Říše Animalia (živočichové) - kmen Arthropoda (členovci) -
podkmen Crustacea (korýši) - třída Branchiopoda (lupenonožci) - řád Cladocera (perloočky) - čeleď Daphniidae (hrotnatkovití) -  rod Daphnia (hrotnatka)
Daphnia pulex (hrotnatka obecná), D. magna (h. velká)
• zástupce zooplanktonu
• akutní i chronické testy
• běžně používaný modelový organismus
(OECD 1984)               _ citlivost k toxikantům
- rychlá reprodukce
- determinované toxikologické parametry
- rychlý životní cyklus
-snadná kultivace
- biochemické markery
Normy testů s Daphnia magna
•    ČSN ISO 6341 (75 7751) Jakost vod - Zkouška inhibice pohyblivosti Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) - Zkouška akutní toxicity
•    ČSN ISO 10706 (75 7752) Jakost vod - Stanovení chronické toxicity látek pro daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
•    ISO 6341/1996 Water quality - Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) - Acute toxicity test
•    ISO 1070/2000 Water quality - Determination of long term toxicity of substances to Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
•    OECD 202 Daphnia sp. Acute Immobilisation Test   (Updated Guideline, adopted 4th April 1984)
•    OECD 211 Daphnia magna Reproduction Test (Original Guideline, adopted 21st September 1998)
Permanentní laboratorní chov Daphnia magna
•  kultivační místnost
•  stálá teplota 20 ± 2°C
•  stálá fotoperioda 16h světla/8h tmy
•  stálé pH
•  kultivační médium M4
•  pravidelné krmení
směsí řas
3-5 mm dlouhý, převážně planktonický sladkovodní živočich dospívají během 6-10 dní, množí se partenogeneticky, životnost až 56 dní při 20°C
Akutní test na Daphnia magna
Cíl: určení počáteční koncentrace, která v testu imobilizuje 50% jedinců Daphnia magna
Podmínky akutního testu:
• jedinci mladší 24 hodin, získaní partenogenezí
•  expozice 24/48 h, bez aerace, bez krmení, bez úpravy pH
•  standardní médium (CaC03, MgS04, NaHC03, KCl)
•  bez osvětlení nebo 16 h světla / 8 h tmy, teplota 20°C±2 °C
•  pH 6-9 (změna během testu max.± 1,5)
•  během testu měříme pH, teplotu, 02
•  rozpuštěný kyslík > 2mg/l / > 3 mg/l
•  referenční látka:dichroman draselný
Zpracování a příprava vzorků vody
•  Láhve se naplní vzorkem, aby se zamezilo přístupu vzduchu.
•  Zkouška toxicity se provede co nejdříve po odběru, nejpozději do 6 hod. Pokud není možné tento interval dodržet, vzorek se na místě odběru zchladí na +4°C [nebo zmrazi na -20°C]. V tomto případě musí být vzorek zpracován do 48 hod.
KV
•y
r
i
Vlastní zkouška:
Nejméně: 20 jedinců na koncentraci (4x5ml/5ks),
5 organismů na jamku či nádobku
•    nádobka 5-10ml/ks (30 jamková destička (10 ml)) - 2 ml testovaného roztoku na jedince
po 5 jedincích do každé jamky
nejméně 20 jedinců
A
ředící jamka
testovací jamky
Zkoušené roztoky: min. 5 koncentrací + kontrola (testovaná látka + ředící médium)
Sledovaný parametr: imobilizace po 24, 48 hodinách - počítáme mobilní jedince - kriterium imobilizace: jedince, kteří nejsou schopni se rozplavat ani po 15s mírném zamíchání považujeme za imobilizované, i kdyby ještě pohybovali tykadly
Platnost výsledků = validita testu
Koncentrace rozpuštěného kyslíku na konci zkoušky je větší anebo se rovná 2 mg.l" Procento imobilizace kontrolních vzorkuje menší než nebo se rovná 10% 24h-EC50i pro dichroman draselný je v rozsahu od 0,6 do 1,7 mg.1-1
Vyjadřování výsledků
Hodnocení:
Počet imobilních jedinců
počáteční inhibiční koncentrace - hodnoty EC50 (pro 24h a 48h) popř. nejnižší c pro 100% imobilizaci a nejvyšší c pro 0% imobilizaci
Hodnoty 24h-EC50i, 48h-EC50i a limity odpovídající 0% a 100% imobilizace
se vyjadřují:
U odpadních vod v procentech ředění
U chemických látek v miligramech na litr
ALTERNATIVNÍ MIKROBIOTESTY ("toxkitv") s bezobratlími
www. microbiotests. be
"Test organisms are included in the kits as "dormant eggs (cysts) " which can be hatched "on demand'
ROTOXKIT F
citvottic
Contains all the materials to
perform three
48h reproduction assays
THAMNOTOXKIT F™
MICROBIOTESTS
With the
crustacean
Thamnoceph altts
platyurus
PROTOXKIT F™
MICROBIOTESTS
With the ciliate
protozoan
Tetrahymena
thermophila
MIKROBIOTESTY
http://www.microbiotests.be/
•   Výhody: miniaturizace, zkrácení doby inkubace a tím i zjednodušení
•   Možnost dlouhodobého uchovávání testovacích organizmů ve formě kryptobiotických klidových stádií,
v lyofilizováném nebo imobilizováném stavu.
•   Organizmy se před použitím v testech uvedou do aktivního stavu.
•    Synchronně vy líhli j edinci j sou uniformní a pocházej í z geneticky přesně definovaných zásobních kultur.
•   V současnosti jsou mikrobiotesty komerčně dostupné v podobě tzv. toxkitů
MIKROBIOTESTY
DAPHTOXKIT FTM magna, DAPHTOXKIT FTM pulex: 24-48h test akutní toxicity pro korýše Daphnia magna a Daphnia pulex fbdpovídá OECD a ISO normám)
CERIODAPHTOXKIT FTM: 24 h test akutní toxicity pro korýše Ceriodaphnia dubia (odpovídá USEPA normě)
THAMNOTOXKIT FTM: 24 h test akutní toxicity pro korýše Thamnocephalus platyurus (Test s Thamnocephalem u nás normován TNO)
OSTRACODTOXKIT FTM: 6 denní chronický test toxicity (mortalita/inhibice růstu) s korýšem Heterocypris incongruens. První kontaktní mikrobiotest pro kontaminované sedimenty nebo půdy
ROTOXKIT FTM: 24 h test akutní toxicity pro vířníka Brachionus calyciflorus (odpovídá standardní normě ASTM E1440-91).
ROTOXKIT FTMshort -chronic: 48h krátký-chronický (reprodukční) test s vířníkem Brachionus calyciflorus (odpovídá francouzské normě AFNOR)
PROTOXKIT FTM: 24h chronický (inhibice růstu) test toxicity pro prvoka Tetrahymena thermophila. Metodika pro odpovídající test je vyvíjena v OECD.
RAPIDTOXKIT (tm): Hodinový test toxicity s larvami korýše Thamnocephalus platyurus pro rychlou detekci kontaminace vody.
Mikrobiotesty
Thamnotoxkit
•    Testovací organismus Thamnocephalus platyurus
•    Uchovávání: klidová stádia
•    Doba líhnutí: 20 hod., 4000 lx, 20°C
•    Inkubace: 24 hod., 4000 lx, 20°C
•    Vyhodnocení: mortalita, 24 LC50
Výhody: 20 h líhnutí, větší, citlivý organismus, expozice 24-48 h, srovnatelné výsledky s dafnií (+ citlivější) i zakalené/zabarvené vzorky, jev TNV
Obdobně CERTODAPHTOX
Ceriodaphnia dubia
ODVETVOVÁ TECHNICKÁ NORMA VODNÍHO HOSPODÁŘSTVÍ
MZeČR
MIKROMETODA STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY NA KORÝŠI THAMNOCEPHALUS PLATYURUS
TNV 75 7754 Obsah                                                                                                                   Strana
1.                Předmluva.......................................................................................................       1
2.                Predmet normy..................................................................................................      2
3.                Termíny, definice a zkratky.................................................................................      2
4.                Podstata zkoušky...............................................................................................      3
5.                Materiály a chemikálie.........................................................................................     3
6.                Prístroje a pomůcky............................................................................................     4
7.                Príprava vzorků zkoušené vody...........................................................................     4
8.                Postup zkoušky....................................................................................................     5
9.                Vyjadřování výsledků............................................................................................    7
10.              Protokol o zkoušce...............................................................................................   7
11.              Příloha A (informativní) - Korýš Thamnocephalus platyurus.................................. 8
12.              Přílohy B (informativní) - Limitní hodnoty pro Thamnocephalus platyurus.............  9
13.              Příloha C (informativní) - Literatura.......................................................................    10
Rotoxkit F
•   Testovací organismus:
Brach ion us calycifloris (vodní vířní k)
•    Uchování: klidová stádia, cysty
•    Doba líhnutí: 18 hod., 20°C, 4000lx
•    Design: 6 opakování, 6 koncentrací v jedné destičce, jamka á 0,3 ml
•    Inkubace: 24 hod., 20°C, 4000lx
•   Vyhodnocení: mortalita, 24 LC50
Výhody: Domácí běžný druh, přídavná informace
Nevýhody: Malý, většinou méně citlivý
Závěr: zajímavý doplněk testů toxicity, není nutný, je-li v baterii korýš
Obdobně Protoxkit s prvokem Tetrahymena thermophila
Líhnutí cys virniku
15 mJ
standardní voda
ja»ka'pro lihnutí
cysty
Ü
anpulka s cystami
Testovací destička
r\
ABODE»
^
(OOOOOOO
(O'OOOOOO (O'OOOOOO (O'OOOOOO (O'OOOOOO 0)000000
s'",
(1000-4000 lux)
10-15 min
Inlcubace 16-18 hod pri 25°c
í   .■•■!
Plnění testovací destičky
radící voda
C5
4
C4
C3   \J
C2
řáděni toxické látky
0.7m!
0.3 ml

r\r.
"OOOOOO
tOOOOOOO
OOOOOO
'OOOOOO
€3000000
yooooooo
testovací destička
\J
Přenos vířniků
do testovacích
jamek
	1      Přenos cca 50 vířniků do každé ředící jamky 5 vířniků v testovací					janče	
						E D i DC DC DC DC pc	
oooooc ( >ooooc c xdoooc ( >ooooc l±Jc_405QQQQC							D D D D D D
							
jamky pro test lihnuti       -jamka
Daphtoxkit pulex
Výhody
Jako ISO, OECD Z klidových stádií
Nevýhody
3 dny líhnutí
Nevyrovnané líhnutí
Problémy se skladováním
Povrchové tenze -neplavou
Závěr: zatím není zcela vyladěný
RAPIDTOXKIT
Test s nejrychlejší odpovědí
„jídelní test" - sledováno ovlivnění příjmu potravy stresem (toxickou látkou)
Testovací organismus: Thamnocephalus platyurus
Uchování: klidová stádia, cysty
Doba líhnutí: 30-45 hod., 25°C, 4000lx
Inkubace: 15-60min, 25°C, 4000lx
Pak přidány červeně obarvené mikrospory (potrava), inkubace 15-30 min
Vyhodnocení: pod mikroskopem zhodnocen příjem potravy v jednotlivých expozičních variantách -hodnocena inhibice příjmu mikrosporv porovnání s kontrolou
Suspected water
\J
•':
Control water
Expose the test organisms (smalt larval crustaceans) hatched from dormant eggs to the suspected water and a control water, for a short period of time (15 minutes, to 1 hour)
Add red microspheres and allow the lest organisms to take up the particles during 15-30 minutes
Obsen'e the coloration of the digestive tract of the larvae under a stereomicroscope
No uptake (or significantly decreased uptake) of the red microspheres points to the presence of « unwanted » compounds which should trigger attention and action
Y
E S
SL
N O
KJ
-> •!•
Toxic hazard ?
Testy toxicity na korýších/vířnících
VALIDITA: Výsledky testu jsou považovány za platné, když
•   Koncentrace  rozp.  kyslíku  neklesla  pod  60% nasycení
•   Koncentrace testované látky neklesla pod 80%
•   Mortalita kontrolního vzorku nepřesáhla 10%
•   Zjištěná   koncentrace   LC50   je   v   souladu   se standardy
PŮDA + SEDIMENTY
Mikrobiotest - OSTRACODTOXKIT FTM:
6 denní chronický test toxicity (mortalita/inhibice růstu) s korýšem Heterocypris incongruens. Kontaktní test v mikrodeskách 3x2 jamky (objem 1 ml). 10 j edinců na j amku,
iTM
Uchování: klidová stádia, cysty Doba líhnutí: 52 hod., 25°C, 40001x Inkubace: 6 dní, 25°C, 40001x Vyhodnocení: mortalita, 24 LC50, růst
OSTRACODTOXKIT F
MICROBIOTESTS FOR SEDIMENT TOXICITY TESTING
With the
benthic crustacean
Heterocypris
incongruens
Testy toxicity s bezobratlými
Ekonomické hodnocení
(orientační ceny bez cla a dopravy)
•  Rotoxkit, Thamnoto.....................................1000KČ
•   Daphtoxkit..................................................1300KČ
•  Algaltoxkit..................................................4300KČ
•   ECHA Biocide monitor................................ 200KČ
•   MetPad.............................................. 500KČ
•  Toxichromotest (SedimentChromoPad), Toxichromotest....................................10OOKč
Chronické testy s vodními bezobratlými živočichy
Akvatické testy
•    Reprodukční test s hrotnatkou Daphnia spp. (ISO 1070/2000)
•    Test přežívání a reprodukce s břichatkou Ceriodaphnia dubia (USEPA, 1989)
•    Chronické biotesty s vidlonožci (Mysidacea - řád korýšů z podtřídy rakovců) - mořští, pronikají i do brakických a sladkých vod
Sedimentové testy
10-denní test přežívání a růstu s ruznonožcem Hyalella azteca (USEPA, 2000)
42-denní test přežívání, růstu a reprodukce s ruznonožcem Hyalella azteca (USEPA, 2000)
10-denní test přežívání a růstu s pakomárem Chironomus tentans (USEPA, 2000)
Celoživotní (Life-cycle) test pro hodnocení účiků kontaminace sedimentů s pakomárem Chironomus tentans (USEPA, 2000)
Chronický test na Daphnia magna
ČSN ISO 10706 Jakost vod - Stanovení chronické toxicity látek pro Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
• organismy mladší 24h
•  10 organismů na koncentraci
• individuálně v 50ml media M4/kádinku
• médium výměna 3x týdně
• expozice 21 dní
•  teplota 20 ± 2°C
•  pH 6-9 (±1,5)
•  rozpuštěný 02 > 3mg/l
•  fotoperioda 16 h světla / 8 h tmy
•  krmení směs řas
Jednou týdně: 02, teplota, tvrdost a pH v médiu, kontrolních nádobách a u nejvyšší zkušební koncentrace.
Příprava média Elendt M4
Zásobní roztoky
SrCl2.6H20
MnCl2.4H20
ZnCl2
CoCl2.6H20
Na2Se03
CuCK.2H.O
H3BO3
LiCl
RbCl
NaBr
KI
NH4V03
CaCl2.2H20, NaHC03, NaN03 MgS04.7H20, KH2P04, KCl,   K2HP04, Na2Si03.9H20
Roztok I (stopové prvky)
Thiamin
hydrochlorid,
Biotin,
Cyanocobalamin
Roztok II. '(makroživiny
vitamíny)
Zkušební roztok a zkušební koncentrace
Zkušební koncentrace se připravuje alespoň v pěti variantách s faktorem <3,2 (geometr, řada)
cn = c0*qn    n =1,2,3,...
Rozptyl koncentrací se nastavuje podle cíle testu:
•      LOEC/NOEC
•      EC
X
Nepoužívá se koncentrace se statisticky významným
účinkem na přežití dospělců -> toxicita pro reprodukci a mortalitu
Rozpouštědla a dispersanty do 0.1 ml/l, lépe je nepoužívat
240 220 200 180 •g 160
C
HL 140
.c o
•^ 120
(D N
§ 100
C
S  80
o
Q.
60
40
20
0
Sledované parametry
Mortalita, přežívání
Reprodukce
Počet narozených j uvenilů
Den první reprodukce
Chování - způsob pohybu
koncentrace 15 mg/l
						
						
						
						
						
						
-•— control -■- Biaw\s		S				
-»- AQ.EXTT -*- C18 PER		WCT MEATE				
	-•- C18 ELU	ATE				
						
						
						
						'                     *
						
						
						
			-^^f                     i^^			
ľ						
10
12
14                   16
čas (dny)
18
20
22
koncentrace 135 mg/l
100
80
60
40
20
^S
contorl
bioMass aq. extract c18 permeate
C18 ELUATE!
X
-♦---♦---♦-
0    2    4    6    8    10    12    14    16    18   20   22
čas (dny)
další parametry (zbarvení, tukové kapénky, velikost gonád)
- měření délky matečných organismů na konci zk.
- velikost a počet potomků jednoho organismu
- počet potracených plůdků,...
Testy toxicity s bezobratlými
Závěr
pro konkrétní případ, vzorek a problém může zkušený ekotoxikolog vybrat vhodnou kompozici detekčního systému
akutní   testy   toxicity jsou jednou   z   několika součástí systému hodnocení
- chemické analýzy
- struktura zoocenoz a fytocenoz
- biokumulace a biokoncentrace -QSAR
- biomarkery
- atd...